[發明專利]一種共價固定化細胞及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202110628916.1
• 申請日: 2021-06-03
• 公開（公告）號: CN113444717A
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 范小蔓;李瑞芳;黃佳瀅;朱晨媛;徐媛媛;張業旺
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N1/21;C12P7/26;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種共價固定化細胞，其特征在于，所述共價固定化細胞以Fe₃O₄@SiO₂-NH₂-alkyne為載體，連接疊氮基修飾的重組大腸桿菌構建而成；所述Fe₃O₄@SiO₂-NH₂-alkyne載體以四氧化三鐵為內核、采用二氧化硅包覆和炔基修飾，所述疊氮基修飾的重組大腸桿菌中含有甘油脫氫酶基因。

2.一種共價固定化細胞的制備方法，其特征在于，包括：

（1）炔基功能化的磁性納米顆粒的制備：

向Fe₃O₄@SiO₂納米顆粒中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，無氧環境下反應，然后加入丙炔酸，在無氧條件下反應，得到炔基功能化的磁性納米顆粒，記為Fe₃O₄@SiO₂-NH₂-alkyne；

（2）疊氮基修飾后的重組大腸桿菌的制備：

將含有甘油脫氫酶基因的重組大腸桿菌在含有KDO-N₃的培養基中培養，加入IPTG反應，反應結束后室溫下離心、洗滌，得到疊氮基修飾后的重組大腸桿菌，記為疊氮基-重組大腸桿菌；

（3）共價固定化細胞的制備：

將疊氮基修飾后的重組大腸桿菌懸浮于PBS中，得到菌懸液，備用；向Fe₃O₄@SiO₂-NH₂-alkyne中加入Ca²⁺和抗壞血酸鈉預處理，然后向預處理后的Fe₃O₄@SiO₂-NH₂-alkyne中加入菌懸液，混合反應，反應結束后，利用永磁體提供外部磁場進行分離，得到共價固定化細胞；

其中，步驟（1）和（2）不分先后順序。

3. 根據權利要求2所述的共價固定化細胞的制備方法，其特征在于，步驟（1）中，Fe₃O₄@SiO₂納米顆粒、3-氨丙基三乙氧基硅烷和丙炔酸的用量比為1 g: 20 mL: 0.8 mL。

4.根據權利要求2所述的共價固定化細胞的制備方法，其特征在于，步驟（1）中，所述加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，無氧環境下反應的條件為室溫下反應24h；所述加入丙炔酸，在無氧條件下反應的條件為機械攪拌反應過夜。

5. 根據權利要求2所述的共價固定化細胞的制備方法，其特征在于，步驟（2）中，所述KDO-N₃在培養基中的終濃度為5-25 mM；所述培養基為含有50 μg /mL卡那抗性的液體培養基，液體培養基含有質量比為1：1：0.5的胰蛋白胨、氯化鈉和酵母浸膏。

6. 根據權利要求2所述的共價固定化細胞的制備方法，其特征在于，步驟（2）中，IPTG的加入量為0.1-1 mM，加入后反應條件為25℃下誘導表達6 h。

7.根據權利要求2所述的共價固定化細胞的制備方法，其特征在于，步驟（3）中，所述Fe₃O₄@SiO₂-NH₂-alkyne、Ca²⁺和抗壞血酸鈉的質量比為5：1.25：2.5。

8. 根據權利要求2所述的共價固定化細胞的制備方法，其特征在于，步驟（3）中，所述菌懸液的濃度為1.5-15 mg·mL^-1。