[發明專利]一種蛋白酶K突變體及其制備方法

有效

• 申請號: 202110603716.0
• 申請日: 2021-05-31
• 公開（公告）號: CN113234707B
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發明（設計）人: 楊廣宇;趙陽;徐燦;羅漫杰;王梁;施婧妮;宮安
• 申請（專利權）人: 武漢瀚海新酶生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/58
• 分類號: C12N9/58;C12N15/57;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種蛋白酶K突變體及其制備方法，屬于基因工程及酶工程技術領域。本發明提供熱穩定性提高的蛋白酶K突變體，并優化了編碼該突變體的基因。將該突變體或基因用于構建重組表達載體、和重組表達細胞，可在表達量無明顯降低的情況下，獲得蛋白酶K活性和穩定性均提高的突變體，將本發明的蛋白酶K突變體在不添加保護劑的條件下，于25℃儲存12個月仍具有85％以上的酶活力，在60℃下半衰期保持在20min以上，有助于長時間的穩定儲存和運輸。

技術領域

本發明涉及一種蛋白酶K突變體及其制備方法，屬于基因工程及酶工程技術領域。

背景技術

蛋白酶K是由林伯氏白色念球菌(Tritirachium album)分泌的一種重要的絲氨酸蛋白酶，底物譜非常廣泛且具有較高的蛋白水解活性。蛋白酶K不僅可用于生化實驗中，如在核酸提取中，可以除去核酸中的DNA酶和RNA酶；在原位雜交中，蛋白酶K具有降解包圍靶DNA蛋白質的作用，可以用來處理雜交前的樣本，提高檢測的敏感性，還可以用于IVD生化檢測試劑和分子診斷試劑中。

一般條件下蛋白酶K使用的pH范圍是7.5-9.0之間。蛋白酶K在20-60℃之間活性都可以達到80％以上，蛋白酶K與其他蛋白酶的區別還在于該酶在含有Triton X-100、尿素、SDS、鹽酸胍的環境中仍能穩定存在且具有活性，這一特性使它的應用很廣泛。

早期商業化供應的蛋白酶K主要由林伯氏白色念球菌分泌獲得。林伯氏白色念球菌生長緩慢，難以高密度培養，蛋白酶K的產量較低，林伯氏白色念球菌還會分泌其他的蛋白酶，增加了下游分離純化的難度。后來羅氏診斷等公司利用畢赤酵母表達體系實現了蛋白酶K的分泌表達，提高了蛋白酶K的產量，降低了其純化成本，同時提升了蛋白酶K的品質。

2020年新冠病毒爆發后，世界對用于分子診斷的蛋白酶K需求越來越大，但野生型蛋白酶K在常溫保存及運輸時的穩定性差，采用低溫冷鏈運輸的方式在跨國時會帶來更高的運輸成本。常溫運輸使用的集裝箱溫度通常會在運輸過程中出現溫度升高的問題，據統計，集裝箱自6℃的新澤西州出發，在海上航行運輸過程中，沿大平洋航線的溫度可達30～35℃之間，由亞洲到非洲，大西洋，印度洋，中東，紅海航線的集裝箱溫度可達45～60℃。為了實現蛋白酶在不具備溫控設備的集裝箱中長時間運輸后保持活力不變，急需篩選出熱穩定性大幅度提高的蛋白酶K。

發明內容

本發明根據蛋白酶K的三維晶體結構，通過理性設計得到蛋白酶K的突變體，并優化了編碼蛋白酶K的基因的核苷酸序列，提供了突變體在畢赤酵母表達體系表達和蛋白純化的方法，為分子級別蛋白酶K的規模化生產奠定了基礎。

本發明的第一個目的是提供一種林伯氏白色念球菌(Tritirachium albumlimber)來源的蛋白酶K突變體，具有如下任一種突變：F356V，F356W，F356P。

在一種實施方式中，所述蛋白酶K突變體為(a)或(b)：

(a)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基礎上，對第356位氨基酸進行了突變，

(b)與(a)具有至少98％序列同一性，且具有蛋白酶K活性的由(a)衍生的蛋白質。

在一種實施方式中，所述蛋白酶K突變體為(a)或(b)：

(a)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基礎上，對第356位氨基酸進行了突變，

(b)與(a)的氨基酸序列第1～355位，第357～369位氨基酸序列具有至少98％序列同一性，且具有蛋白酶K活性的由(a)衍生的蛋白質。

在一種實施方式中，所述蛋白酶K突變體為(a)或(b)：

(a)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基礎上，對第356位氨基酸進行了突變，