[發明專利]基因工程高產菌株淀粉酶產色鏈霉菌及ε-聚賴氨酸的生產方法和應用

有效

• 申請號: 202110597084.1
• 申請日: 2021-05-31
• 公開（公告）號: CN113897301B
• 公開（公告）日: 2023-10-27
• 發明（設計）人: 譚之磊;董天宇;賈士儒;侯穎;唐昆鵬;周東浩;閆佳佳;許倍銘
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/21;C12N15/76;C12P13/02;C12R1/525
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

1.一種淀粉酶產色鏈霉菌，其特征在于：名稱為：6#-7，分類命名為：淀粉酶產色鏈霉菌Streptomyces diastatochromogenes，保藏編號為：CGMCC No.22261，保藏日期：2021年4月30日，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。

2.一種基因工程高產ε-聚賴氨酸菌株淀粉酶產色鏈霉菌，其特征在于：所述淀粉酶產色鏈霉菌通過將脂肪酸合成代謝通路中的關鍵基因脂肪酸ACP合酶基因fabF在Streptomyces diastatochromogenes 6#-7中分別敲除得到的。

3.根據權利要求1所述的基因工程高產ε-聚賴氨酸菌株淀粉酶產色鏈霉菌，其特征在于：所述Streptomyces diastatochromogenes 6#-7的名稱為6#-7，分類名稱為Streptomyces diastatochromogenes，保藏編號為：CGMCC No.22261，保藏日期：2021年4月30日，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；敲除的基因序列分別為fabF1、fabF2、fabF3，基因堿基序列與SEQ No.32、No.33、No.34相似性達90％以上。

4.如權利要求2或3任一項所述的基因工程高產ε-聚賴氨酸菌株淀粉酶產色鏈霉菌的構建方法，其特征在于：步驟如下：

(1)提取原始S.diastatochromogenes 6#-7的基因組；

(2)以步驟(1)提取得到的基因組為模板，采用PCR技術擴增目的基因上下游同源片段；

(3)利用SOE-PCR，將步驟(2)得到的上下游同源片段與用于替換目的基因的抗性片段連接，得到用于敲除目的基因的敲除組件；

(4)將純化后的融合片段即敲除組件和出發載體pJTU 412分別進行EcoR I單酶切，16℃條件下，在T4 DNAligase作用下與融合片段進行過夜連接，得到攜帶敲除目的基因的敲除組件的重組質粒；

(5)將步驟(4)構建得到的重組質粒轉化至大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，通過接合轉移法將所述的表達載體整合入S.diastatochromogenes6#-7的基因組中，獲得基因工程高產ε-聚賴氨酸菌株淀粉酶產色鏈霉菌。

5.根據權利要求4所述的基因工程高產ε-聚賴氨酸菌株淀粉酶產色鏈霉菌的構建方法，其特征在于：所述步驟(3)中抗性為安普霉素抗性。

6.根據權利要求4所述的基因工程高產ε-聚賴氨酸菌株淀粉酶產色鏈霉菌的構建方法，其特征在于：所述步驟(4)中攜帶敲除目的基因的敲除組件的重組質粒的具體構建步驟如下：

(1)敲除組件的獲得：敲除組件包含fabF基因的等位位點，即該基因的上游同源片段及下游同源片段，以及用于替換目的基因的抗性即安普霉素抗性片段作為篩選標記；

以S.diastatochromogenes 6#-7的基因組為模板，根據fabF基因分別設計上下游同源片段引物序列fabF-F/fabF-R；以pSET 152質粒為模板，根據安普霉素Apr抗性基因設計引物序列apr-F/apr-R；

在敲除組件上下游兩端分別添加8個核苷酸，形成限制性內切酶EcoR I的酶切位點；

(2)重組質粒的構建：將純化后的融合片段和出發載體pJTU 412分別進行EcoR I單酶切，16℃條件下，在T4 DNAligase作用下與融合片段進行過夜連接，連接產物通過化學轉化的方法轉入到E.coli DH5α感受態篩選轉化子，保存。

7.根據權利要求4所述的基因工程高產ε-聚賴氨酸菌株淀粉酶產色鏈霉菌的構建方法，其特征在于：所述步驟(4)中pJTU 412質粒不僅包含來源于大腸桿菌質粒的復制起始位ori COlEI點，也包含來源于鏈霉菌質粒的復制起始位點ori pIJ101。

8.如權利要求2或3所述的基因工程高產ε-聚賴氨酸菌株淀粉酶產色鏈霉菌在ε-聚賴氨酸制備方面中的應用。