[發明專利]一種用于檢測人HLA-B*1502基因突變的特異性引物探針組合及其試劑盒，以及方法

在審

• 申請號: 202110594503.6
• 申請日: 2021-05-28
• 公開（公告）號: CN113308532A
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 何炯;魏寧;張輝;查廣彬
• 申請（專利權）人: 上海康黎診斷技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6881;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 余永莉

1.一種用于檢測人HLA-B*1502基因突變的特異性引物探針組合，其特征在于，包括以下引物和探針序列：

針對人HLA-B*1502基因的上游引物Fp1：5'-GCGAGTCCGAGGATGGCGCCC-3'；

針對人HLA-B*1502基因的下游引物Rp1：5'-TTGTAGTAGCCGCGCAGGTTC-3'；

識別人HLA-B*1502基因突變的探針probe1：5'-FAM-AACACACAGATCTCCAAGACCAACACACAG-BHQ1-3'；

針對內參基因人RPPH基因片段的上游引物Fp2：5'-CCGCCTCTGGCCCTAGT-3'；

針對內參基因人RPPH基因片段的下游引物Rp2：5'-GCCACGAGCTGAGTGCGT-3'；以及

識別內參基因人RPPH基因片段保守序列特異性的探針probe2：5'-VIC-TGTCACTCCACTCCCATGTCCCTTGG-BHQ1-3'。

2.一種用于檢測人HLA-B*1502基因突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括根據權利要求1所述的用于檢測人HLA-B*1502基因突變的特異性引物探針組合。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括反應液，純水、陽性對照和陰性對照；其中，所述反應液的成分包括：Tris緩沖液，MgCl₂，dNTP，引物，探針，Taq酶，UDG酶，PCR增強劑，水；所述陽性對照為含有HLA-B*15：02基因型部分序列和Control基因部分序列的質粒，所述陰性對照為不含待測區域DNA序列的質粒。

4.一種用于檢測人HLA-B*1502基因突變的TaqMan探針實時熒光PCR方法，用于非疾病診斷目的，其特征在于，包括以下步驟：

1)針對人HLA-B*1502基因以及內參基因人RPPH基因的序列特點，設計出如權利要求1所述的引物探針組合；

2)獲得抽提的待測樣本基因組DNA；

3)在同一個反應體系中，將如權利要求1所述的特異性引物探針組合按照一定比例混合，加入反應液中；

4)進行實時定量熒光PCR檢測；

5)在同時滿足下列條件時，結果可以判定待測樣本為人HLA-B*15:02基因突變為陽性：a.RPPH的Ct值≤35；b：HLA-B1502的Ct值RPPH的Ct值。

5.根據權利要求4所述的TaqMan探針實時熒光PCR方法，其特征在于，反應體系以20μL計，引物和探針的終濃度分別為：Fp1：0.1～0.4μM；Rp1：0.1～0.4μM；probe1：0.08～0.3μM；Fp2：0.1～0.4μM；Rp2：0.1～0.4μM；probe2：0.08～0.3μM。

6.根據權利要求4所述的TaqMan探針實時熒光PCR方法，其特征在于，反應體系以20μL計，所述反應液的成分為：1～1.5U的DNA聚合酶，0.2～0.45mM的dNTP(A,G,C,U)，0.3～0.6U的UDG酶，45～60mM Tris-HCl(PH＝9)，18～22mM(NH₄)₂SO₄，1.8～2.2mM Mg²⁺SO₄，0.8～1.2％甘油，0.08～0.12mg/ml BSA。

7.根據權利要求4所述的TaqMan探針實時熒光PCR方法，其特征在于，步驟4)中采用的擴增程序為：30℃，10min，1個循環；95℃，10min，1個循環；95℃，30s，65℃，30s，40個循環。