[發明專利]云南騰沖來源四氫嘧啶合成基因簇及其應用

有效

• 申請號: 202110589640.0
• 申請日: 2021-05-28
• 公開（公告）號: CN113308482B
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發明（設計）人: 董欣欣;魏燾;馬驍;王飛飛;蘇溫柔
• 申請（專利權）人: 深圳中科欣揚生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/60;C12N9/10;C12N9/88;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

本發明公開了云南騰沖來源四氫嘧啶合成基因簇及其應用。本發明具體地公開了包含編碼氨基丁酸乙酰基轉移酶(EctA)、二氨基丁酸氨基轉移酶(EctB)和四氫嘧啶合成酶(EctC)的新的四氫嘧啶生物合成基因簇，并以大腸桿菌為底盤細胞，將三個基因整合到pBAD/HisA載體中，構建出了高產四氫嘧啶的基因工程菌，通過優化發酵條件、誘導劑濃度等增強基因表達量，從原料天冬氨酸鈉出發進行生物轉化，增加四氫嘧啶的生物合成，本發明的高產四氫嘧啶的基因工程菌發酵罐培養72h的產量可達10.02g/L，該產量已達到國際先進水平。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及云南騰沖來源四氫嘧啶合成基因簇及其應用，具體涉及云南騰沖來源的類芽孢桿菌四氫嘧啶合成基因簇、重組表達載體、高產四氫嘧啶的大腸桿菌工程菌及其應用。

背景技術

四氫嘧啶又名四氫甲基嘧啶羧酸(Ectoine，C₆H₁₀N₂O₂)，是一種廣泛存在于嗜鹽菌中參與滲透壓調節的雜環氨基酸衍生物。作為一種相容性小分子，四氫嘧啶在極端環境中扮演著保護者的角色，對生物體內的蛋白質活性、核酸構象、微環境穩態的維持均有著積極的作用。四氫嘧啶作為一種功能強大的保護劑，通過穩定和保護細胞而減少外界因素對細胞的破壞性影響，這種保護機制能夠保護皮膚免受各種消極因素，包括干燥，空氣污染，紫外線和可見光輻射的影響，從而實現抗衰老的功效。此外，四氫嘧啶對正常細胞也有積極作用，當使用四氫嘧啶時，細胞的功能也會得到增強。研究表明，四氫嘧啶可恢復和穩定角質層屏障功能，從而依據其科學的防護和抗炎功效而增加皮膚含水量。四氫嘧啶還表現出全方位和多層次的抗污染功效，能夠抑制和減少各種空氣污染成分：包括PAHs，重金屬，二氧化氮以及大多數顆粒物質對皮膚和皮膚細胞的傷害。四氫嘧啶已被批準用于慢性阻塞性肺病的治療和預防使用，用于治療和預防COPD和哮喘等。近年來發現，四氫嘧啶對變態反應性疾病有一定緩解作用。另外，四氫嘧啶還可以抑制類淀粉蛋白的形成，能夠降低類淀粉蛋白形成的起始和伸長階段，具有潛在的預防老年癡呆癥的功能。總之，四氫嘧啶是多功能、安全的活性成分，其功效已經通過臨床驗證，因此被廣泛應用在醫療健康、生物制劑、化妝美容、制藥等領域中，具有重要的開發和應用價值。

由于四氫嘧啶分子中具有一個手性碳原子，因此很難用化學方法合成，目前四氫嘧啶的主要生產方式為微生物催化法和生物合成方法。微生物催化法即傳統的微生物發酵方式，如采用延長鹽單胞菌(Halomonas elongate)菌株發酵，在發酵過程中通過改變鹽濃度來刺激菌體積累更多的產物，或者利用“細菌擠奶”原理實現四氫嘧啶的合成和分泌。但這些傳統方法生產四氫嘧啶，受限于菌株本身合成能力，產量有限，同時生產所需要的高鹽環境對生產設備腐蝕傷害極大，生產成本極高，不適合大規模的工業化生產。采用生物合成法生產四氫嘧啶是近年來的發展趨勢，通過基因工程技術選育高產優良菌株，開發一種高效的四氫嘧啶生產方法，提高四氫嘧啶的產量，從而降低其生產成本，具有重要的經濟價值和社會意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種新穎的四氫嘧啶生物合成基因和基因簇，以及利用該基因簇構建的高產四氫嘧啶的菌株。

為解決上述技術問題，本發明首先提供了核酸分子，名稱為NEctABC，所述核酸分子編碼名稱分別為EctA、EctB和EctC的三種蛋白質；

所述EctA為下述任一種蛋白質：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白質；

A2)將SEQ ID No.1的氨基酸序列經過一個以上氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與A1)所示的蛋白質具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白質；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端連接標簽得到的融合蛋白質；

A4)在A1)或A2)的N端和/或C端和/或氨基酸側鏈基團上進行修飾得到的具有相同功能的蛋白質衍生物；