[發(fā)明專利]共同檢測(cè)流行性出血病病毒和帕利亞姆血清群病毒的RPA-LFD引物、探針及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110587459.6
• 申請(qǐng)日: 2021-05-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113265488B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-11-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李卓然;廖德芳;楊恒;李占鴻;楊振興
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司 53100
• 代理人: 徐玲菊;于洪

本發(fā)明涉及一種共同檢測(cè)流行性出血病病毒和帕利亞姆血清群病毒的RPA?LFD引物、探針及試劑盒，屬于動(dòng)物病毒分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明設(shè)計(jì)了共同檢測(cè)EHDV和PALV的引物和nfo探針，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建一種能夠共同檢出流行于中國(guó)的EHDV和PALV核酸的RPA?LFD檢測(cè)試劑盒，該試劑盒具有特異、敏感、快速、高效以及能夠等溫?cái)U(kuò)增并用于現(xiàn)場(chǎng)快速診斷等優(yōu)勢(shì)，易于推廣應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及共同檢測(cè)流行性出血病病毒和帕利亞姆血清群病毒的重組酶聚合酶-側(cè)流層析試紙檢測(cè)引物、探針及檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

流行性出血病病毒(epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)和帕利亞姆血清群病毒(palyam serogroup virus,PALV)均為呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)成員，廣泛流行于北緯49°至南緯35°之間的熱帶以及亞熱帶地區(qū)。EHDV和PALV主要通過(guò)雌性庫(kù)蠓(Culicoides spp.)對(duì)反芻動(dòng)物的吸血性叮咬進(jìn)行傳播。EHDV能夠?qū)е卤桓腥镜陌孜猜拱l(fā)生死亡，以前認(rèn)為只有屬于EHDV-2型的Ibaraki毒株可導(dǎo)致被感染牛出現(xiàn)類似藍(lán)舌病的臨床癥狀，但近年來(lái)EHDV-1、-6和-7型病毒在土耳其、以色列和日本流行并且引起奶牛大量減產(chǎn)。EHDV已于2008年被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報(bào)告的跨境動(dòng)物疫病。而PALV感染則主要導(dǎo)致妊娠動(dòng)物的生產(chǎn)異常，主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)或產(chǎn)無(wú)腦畸形胎。1985年至1986年，PALV相關(guān)的疫情曾在日本暴發(fā)，其臨床癥狀為新生牛先天性異常，并伴有水腦畸形和小腦發(fā)育不良綜合征。EHDV和PALV都給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

EHDV和PALV基因組均由10個(gè)節(jié)段的雙鏈RNA(Seg1～Seg10)構(gòu)成，共編碼7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP7)和4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1～NS3和NS3a)。EHDV和PALV具有雙層衣殼結(jié)構(gòu)，外層衣殼由Seg-2和Seg-6編碼的VP2和VP5構(gòu)成，內(nèi)層衣殼則由Seg-3和Seg-7編碼的VP3和VP7構(gòu)成，而由Seg-1、Seg-4和Seg-9編碼的VP1、VP4和VP6以及病毒基因組則共同構(gòu)成病毒核心。世界范圍存在9種EHDV血清型，分別為EHDV-1、-2、-4、-5、-6、-7、-8、-9和-10型。中國(guó)目前有5種血清型EHDV的流行(EHDV-1、-5、-6、-7和-10型)。PALV也具有多種不同的血清型，由于歷史原因，不同血清型的PA LV往往以病毒首次分離地的地名進(jìn)行命名，在亞洲存在Chuzanvirus(CHUV)、D’Aguilar virus(DAV)和Bunyip Creek virus(BCV)三種血清型PALV的流行。

2013年首次在廣西壯族自治區(qū)設(shè)置的哨兵牛血液樣本內(nèi)分離獲得EHDV-5型毒株，隨后在廣東省和云南省等省份分離到EHDV-1、-6、-7和-10型毒株。EHDV血清學(xué)調(diào)查顯示，EHDV廣泛流行于我國(guó)南方地區(qū)，并呈明顯的地域和季節(jié)相關(guān)性，其中廣東省和云南省牛血液樣本中EHDV抗體陽(yáng)性率分別高達(dá)65.08％和68.75％。CHUV于2012年首次分離于我國(guó)云南省的哨兵牛，此外多株BCV和DAV則于2012年至2018年在云南省、廣西壯族自治區(qū)和廣東省分離獲得，提示多種血清型的PALV流行于我國(guó)南方地區(qū)。CHUV血清學(xué)調(diào)查則表明，CHUV已在我國(guó)呈廣泛分布趨勢(shì)，海南省牛羊血清抗體陽(yáng)性率最高可達(dá)57.35％，甚至甘肅省牦牛血清內(nèi)CHUV抗體陽(yáng)性率也可達(dá)7.89％。為了掌握EHDV和PALV在我國(guó)的流行及分布情況，并制定科學(xué)的防控策略，非常有必要建立EHDV和PALV的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷方法。

已有楊振興等和李占鴻等分別開(kāi)發(fā)了實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA(competitiveELISA,C-ELISA)方法用于EHDV和PALV的檢測(cè)，但是上述兩種檢測(cè)方法都存在不足之處。