[發明專利]用于構建人陰道粘膜模型培養基的配制方法

在審

• 申請號: 202110575418.5
• 申請日: 2021-05-26
• 公開（公告）號: CN114134100A
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 李潤芝;盧永波;張勇杰
• 申請（專利權）人: 廣東博溪生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/09
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種用于構建人陰道粘膜模型培養基的配制方法，以DMEM和F12按體積比1～3:1混合的培養基為基礎液，在其中添加10％胎牛血清，添加2.0～6.0μmol/mL的谷氨酰胺，15～30μg/mL腺嘌呤，5～15μg/mL胰島素，0.5～2.0μg/mL氫化可的松，25～100μg/mL維生素C，1～10ng/mL成纖維細胞生長因子和5～20ng/mL轉鐵蛋白。

本分案申請是基于申請號為202110356820.4，申請日為2021年4月1日，發明名稱為“一種體外重建人陰道粘膜模型構建方法”的中國專利申請的分案申請。

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，尤其涉及一種用于構建人陰道粘膜模型培養基的配制方法。

背景技術

人的陰道粘膜由厚的，非角化的，分層的鱗狀上皮組成，富含糖原，以及少量其他類型的細胞，例如巨噬細胞和朗格漢斯細胞。上皮細胞下面為固有層，包含許多彈性纖維和密集的血管網絡，因此陰道粘膜是為局部和全身治療輸送藥物的絕佳途徑。但是由于長期暴露于生殖道管腔內的各種病原體中，陰道上皮也是許多病原體進入體內的潛在部位，例如在使用女性護理和美容產品，避孕藥具或殺微生物劑之后，可能會造成輕度傷害，這可能會引起組織刺激，并使陰道上皮特別容易受到各種類型的感染。藥品，化妝品和個人護理產品等專門配制用于人陰道粘膜的配方有時也會引起不良的局部或全身性副作用。因此，在產品投放市場之前評估新開發的化妝品、個人護理產品或局部應用藥物與人陰道粘膜表面的相容性是制造商需要解決的關鍵問題。

分層分化的人類陰道上皮模型具有克服細胞單層膜的某些缺點的潛力，因為前者包含屏障層并允許局部施用活性成分和最終制劑，包括那些非水溶性的成分。除了可以避免動物福利風險和物種差異問題之外，體外組織模型通常還可以區分動物模型對其不敏感的非常溫和的產品。

法國SkinEthic公司的RHVE模型采用外陰表皮樣癌細胞系A431為種子細胞，細胞系穩定可靠，可以解決種子細胞來源困難問題，但只包含由A431細胞組成的上皮層，缺少基質層細胞和基質，因此在組織結構上還是與天然陰道組織存在較大差異。美國MatTek公司的EpiVaginaL陰道模型和中國專利CN201710048227.7中公開的人陰道上皮3D模型組織結構與天然陰道粘膜高度相似，然而由于可用的陰道組織來源有限，而且陰道黏膜上皮為復層鱗狀上皮，大部分細胞屬于分化成熟細胞，增殖能力較低，僅少部分基底層細胞具有較強的增殖能力，因此體外大量擴增培養條件要求較高，無法實現體外大量生產，滿足市場需求。中國專利CN201710048227.7中公開的人陰道上皮3D模型還存在一些缺陷，如培養體系單一不能適應細胞不同階段的營養需求，導致模型復層化較差，屏障功能較弱，而且該模型構建時間長，體外構建一批模型需要長達一個月時間，過長的生產周期會增加過程中的不可控因素，影響模型的穩定性，目前該模型僅限于實驗室培養，未進行產業化生產，所以國內目前尚未有商業化的人陰道粘膜模型。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種人陰道粘膜模型的體外構建方法。

為實現上述發明目的，本發明采用下述技術方案予以實現：

一種人陰道粘膜模型的體外構建方法，包括如下步驟:

A、含成纖維細胞的基質層構建：

（1）取第5～10代陰道成纖維細胞，用含20%胎牛血清的DMEM配成細胞懸液；

（2）將細胞懸液和中性膠原支架按照1:9的體積比例混勻，接種到細胞培養小室中首次培養，然后在小室內外分別添加HVE-1培養液，二次培養后形成陰道粘膜模型中的基質層；

所述HVE-1培養液按照以下方法配制而成：以DMEM和F12按體積比1～3:1混合的培養基為基礎液，在其中添加10％胎牛血清，添加2.0～6.0μmol/mL的谷氨酰胺，15～30μg/mL腺嘌呤，5～15μg/mL胰島素，0.5～2.0μg/mL 氫化可的松，25～100μg/mL維生素C，1～10ng/mL成纖維細胞生長因子和5～20ng/mL轉鐵蛋白；

B、細胞的接種：