[發明專利]一種棉花隱性核不育恢復同源基因對及其敲除試劑在創造不育系中的應用

有效

• 申請號: 202110575412.8
• 申請日: 2021-05-26
• 公開（公告）號: CN113278629B
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 閔玲;吳元龍;馬歡歡;池華斌;張獻龍
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/113;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/60
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 戴嵩瑋

本發明提供了一種棉花隱性核不育恢復同源基因對及其敲除試劑在創造不育系中的應用，屬于棉花育種技術領域。GhCYP703A2_A基因和GhCYP703A2_D基因屬于恢復基因同源基因對，分別位于棉花At和Dt亞基因組上，恢復基因同源基因對GhCYP703A2_A/D的雙突變使陸地棉花藥絨氈層發育異常、花粉外壁發育缺陷，最終表現出雄性不育表型。因此，本發明通過敲除所述同源基因對創制棉花雄性不育種質，具體采用一組sgRNA或CRISPR/Cas9系統同時敲除棉花中同源基因對GhCYP703A2_A/D，創制出陸地棉新的不育系材料，對雜種優勢利用和群體改良具有非常重要的意義。

技術領域

本發明屬于棉花育種技術領域，具體涉及一種棉花隱性核不育恢復同源基因對及其敲除試劑在創造不育系中的應用。

背景技術

雜種優勢是自然界普遍存在的一種生物學現象，是指遺傳基礎不同的兩個材料雜交，產生的雜種F₁代在生長勢、生活力、繁殖力等方面優于其雙親的現象。目前，雜種優勢已經成功的應用于水稻、玉米、油菜等作物，但未能完全解釋其形成機理(Chen 2013)。與上述作物相比，棉花雜種優勢利用的研究相對滯后。棉花雜種優勢利用主要集中于人工去雄法和雄性不育系法，而隨著人工制種成本的提高，限制了棉花雜種優勢的利用。

棉花隱性細胞核雄性不育系具有敗育徹底穩定、恢復源廣泛、無細胞質不育負效應等優點。經過眾多學者的研究，國內外共發現鑒定了17種類型棉花細胞核不育系(藍家樣等2006)。在這17種類型的細胞核不育系中，棉花雜種優勢主要利用的是洞A(ms14)和ms5ms6兩種類型。利用洞A選育了川雜1號、川雜2號、川雜4號和南雜1號等棉花品種，利用ms5ms6選育了南農6號，南農98-4，中棉所54等棉花品種(陳冬妍2008)。雖然利用棉花核雄性不育系選育了很多的棉花品種，但是利用核不育系制種時需要在田間人工拔除50％的可育株。這不僅僅提高了制種成本，而且會由于可育株拔除不徹底，影響雜交種的純度。因此建立高效的棉花雜交育種體系，對于進一步推廣棉花雜交品種具有重要的意義。

北京大學鄧興旺課題組利用核雄性不育基因成功構建了一個新型的水稻雜交育種技術體系。研究人員通過篩選水稻突變體庫克隆了一個新的水稻雄性不育基因Osnp1，該基因編碼一個葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶，OsNP1在花藥的絨氈層和小孢子中特異表達，調控絨氈層的降解和小孢子外壁的形成。研究人員將育性恢復基因OsNP1與花粉失活基因ZM-AA1和紅色熒光種子標記基因DsRed作為緊密連鎖的元件導入突變體中，獲得可育的雜合體轉基因植株ZHEN18B。由于花粉失活基因只在轉基因雄配子中表達，導致ZHEN18B自交時只有非轉基因花粉能參與授粉，ZHEN18B自交產生不含轉基因成分的不育種子和轉基因的可育種子，分離比為1:1，這兩類種子能夠通過熒光篩選出來(Chang et al 2016)。應用該方法的一個前提條件就是獲得一個細胞核不育系基因及其恢復基因。然而目前還沒有關于棉花隱性核不育恢復同源基因的報道，這無疑對利用恢復基因進行棉花不育系育種提供了較大難題。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種棉花隱性核不育恢復同源基因對及其敲除試劑在創造不育系的應用。

本發明提供了一種棉花隱性核不育恢復同源基因對GhCYP703A2_A/D，所述棉花隱性核不育恢復同源基因對包括以下情形中的一種DNA序列：

1)核苷酸序列如SEQ NO：1和SEQ NO：2中所示的DNA序列；和

2)編碼氨基酸序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示蛋白質的DNA序列。

優選的，所述編碼氨基酸序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示蛋白質的DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

本發明提供了一種用于敲除所述棉花隱性核不育恢復同源基因對GhCYP703A2_A/D的sgRNA組，所述sgRNA組包括sgRNA1和sgRNA2；