[發(fā)明專利]熱穩(wěn)定性提高的葡萄糖氧化酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110574650.7
• 申請日: 2021-05-26
• 公開（公告）號: CN113403290B
• 公開（公告）日: 2023-02-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李陽源;黃江;何小梅;邊葉雨;周銀華;陳麗芝;江民華;黃佳樂;陳瓊銀;賀金玲;劉金山;王勇
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東溢多利生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/81;C12N15/80;C12N1/19;C12N1/15;C12R1/84;C12R1/685
• 代理公司: 北京法信智言知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11737
• 代理人: 尹超群

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及熱穩(wěn)定性提高的葡萄糖氧化酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用。所述葡萄糖氧化酶突變體通過將氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的葡萄糖氧化酶的第4位、第70位、第86位、第96位、第274位、第508位中至少一個氨基酸進行取代獲得。本發(fā)明提供葡萄糖氧化酶突變體，與野生型葡萄糖氧化酶相比，其熱穩(wěn)定性有了顯著的提升，有利于該酶在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。本發(fā)明對來源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶進行分子改造，通過定點突變技術(shù)和易錯PCR方法提高了葡萄糖氧化酶的熱穩(wěn)定性，為葡萄糖氧化酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及熱穩(wěn)定性提高的葡萄糖氧化酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)

葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4，GOD)作為一種高特異性氧化還原酶，能夠催化β-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，并產(chǎn)生過氧化氫(H₂O₂)，在醫(yī)療檢測、食品、生物燃料電池、畜牧養(yǎng)殖等領(lǐng)域發(fā)揮著極其重要的作用。葡萄糖氧化酶作為一種新型的綠色添加劑有其獨特的作用方式，與普通酶制劑不同，它并不是通過改善營養(yǎng)素的消化利用和減輕抗營養(yǎng)因子的方式來改善對其動物生產(chǎn)性能的影響。其方式可能是一方面通過與飼料中葡萄糖作用而產(chǎn)生的葡萄糖酸來發(fā)揮作用，另一方面，葡萄糖氧化酶在與葡萄糖作用過程中消耗O₂，使消化道更易形成厭氧環(huán)境，促使厭氧有益菌的增殖。綜合起來，葡萄糖氧化酶通過在腸道中的作用而可能起到酸化劑和益生菌的作用。

GOD廣泛分布于動植物和微生物體內(nèi)，由于微生物生長繁殖快、來源廣，是生產(chǎn)GOD的主要來源，主要生產(chǎn)菌株為黑曲霉和青霉。葡萄糖氧化酶具有較差的熱穩(wěn)定性，當溫度超過65℃時，葡萄糖氧化酶的酶活快速下降，而飼料制粒過程的溫度在75℃以上，葡萄糖氧化酶較差的熱穩(wěn)定性已成為阻礙其廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵因素。因此，提供熱穩(wěn)定的葡萄糖氧化酶性具有重要的應(yīng)用價值，將帶來巨大的市場競爭力。如何更有效地提高葡萄糖氧化酶耐熱性能也是今后研究的方向。隨著研究的不斷深入，葡萄糖氧化酶的應(yīng)用前景將會更加廣闊。

CN 103981159A公開了一種葡萄糖氧化酶突變體及其應(yīng)用，通過將第172位氨基酸由Asn變?yōu)锳rg，第525位氨基酸由Cys變?yōu)锳sn，提高了突變酶的耐熱性。

目前大多數(shù)酶反應(yīng)需要在較溫和的條件下進行以維持其正?；钚?，而在實際應(yīng)用的逆境中(如高熱、高酸、高鹽等)，酶的耐受性卻較差、容易失活從而導(dǎo)致反應(yīng)效率下降，極大地限制了其推廣和應(yīng)用。因此，對酶分子進行抗逆改造以提高其穩(wěn)定性和催化活性，是當前研究的熱點也是難點。本發(fā)明的葡萄糖氧化酶突變體對于拓寬葡萄糖氧化酶的實際應(yīng)用具有重要價值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供葡萄糖氧化酶突變體。

本發(fā)明的再一目的是提供葡萄糖氧化酶突變體編碼基因。

本發(fā)明的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶突變體編碼基因的重組載體。

本發(fā)明的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶突變體編碼基因的重組菌株。

根據(jù)本發(fā)明提供的熱穩(wěn)定性提高的葡萄糖氧化酶，基于氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的葡萄糖氧化酶的第4位、第70位、第86位、第96位、第274位、第508位中至少一個氨基酸發(fā)生了突變。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，所述突變?yōu)镮4A、I4P、I4Y、D70Q、D70K、A86F、A86*(第86位氨基酸被刪除)、A86Q、S96A、S96N、S96F、G274S、G274Q、G274H、P508A、P508H或P508C中之一或多個組合。

在本發(fā)明的優(yōu)選具體實施方案中，所述取代為I4A、D70K、A86*、S96A、G274Q、P508H。

在本發(fā)明的優(yōu)選具體實施方案中，所述取代為I4P、D70K、A86F、S96A、G274S、P508A。