[發明專利]一對人參屬特異性引物及中成藥內人參屬中藥材的分子生物學鑒定方法

在審

• 申請號: 202110573737.2
• 申請日: 2021-05-25
• 公開（公告）號: CN115386649A
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發明（設計）人: 孫晨;劉可春;巴帥康;靳夢;張云;李寧;盛文龍;夏青;何秋霞
• 申請（專利權）人: 山東省科學院生物研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 濟南竹森知識產權代理事務所(普通合伙) 37270
• 代理人: 朱家富

1.一對人參屬特異性引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示，SEQ ID NO.1為上游引物，SEQ ID NO.2為下游引物。

2.一種鑒定人參屬中藥材的試劑盒Ⅰ，其特征在于，所述試劑盒Ⅰ包括權利要求1所述的人參屬特異性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

3.一種人參屬中藥材特異性DNA分子標記，其特征在于，所述DNA分子標記的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一種鑒定人參屬中藥材的試劑盒Ⅱ，其特征在于，所述試劑盒Ⅱ包括權利要求4所述人參屬中藥材特異性DNA分子標記。

5.如權利要求1所述人參屬特異性引物、權利要求2所述鑒定人參屬中藥材的試劑盒Ⅰ、權利要求3所述人參屬中藥材特異性DNA分子標記、權利要求4所述鑒定人參屬中藥材的試劑盒Ⅱ任一項中，所述人參屬中藥材為三七和/或人參。

6.權利要求1所述人參屬特異性引物、權利要求2所述鑒定人參屬中藥材的試劑盒Ⅰ、權利要求3所述人參屬中藥材特異性DNA分子標記、權利要求4所述鑒定人參屬中藥材的試劑盒Ⅱ任一項在鑒定人參屬中藥材真偽的應用。

7.權利要求1所述人參屬特異性引物、權利要求2所述鑒定人參屬中藥材的試劑盒Ⅰ、權利要求3所述人參屬中藥材特異性DNA分子標記、權利要求4所述鑒定人參屬中藥材的試劑盒Ⅱ任一項在鑒定中成藥內是否含有人參屬中藥材的應用。

8.如權利要求6或權利要求7所述應用中的人參屬中藥材為三七和/或人參。

9.一種利用人參屬特異性引物鑒定中成藥內人參屬中藥材的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)應用植物基因組提取試劑盒，提取中成藥的混合基因組；以提取的混合基因組為模板，利用所述特異性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2進行PCR，獲得人參屬特異產物，即人參屬特異產物長度為350-550bp，人參屬特異產物電泳檢測結果條帶單一，無雜帶，初步判定中成藥內含有人參屬中藥材；如果未獲得人參屬特異產物，則直接判定中成藥內不含有人參屬中藥材；

(2)在步驟(1)中初步判定中成藥內含有人參屬中藥材后，以步驟(1)中提取中成藥的混合基因組為模板，利用ITS2通用引物進行PCR，獲得含有多種中藥材ITS2序列的混合產物；應用DNA連接酶將獲得的含有多種中藥材ITS2序列的混合產物分別插入線性化的pCR4Blunt-TOPO質粒中，隨后將該質粒轉染到宿主細胞，使其形成單克隆，完成ITS2混合序列的分離；

(3)中成藥內人參屬中藥材特有ITS2序列的鑒定，挑取一定數量的步驟(2)中的單克隆，制備液體培養物；

應用質粒小提試劑盒，分別提取液體培養物中的單克隆質粒；

應用sanger測序法對提取的單克隆質粒進行核苷酸序列檢測；

應用SeqMan與Chromas軟件，根據產物長度、Q值，對測序結果進行序列拼接與校對；

將拼接校對后的測序結果分別放入數據庫中進行比對，根據E Value、Max Score和PerIden的得分，對測序結果進行鑒定，明確中成藥的混合基因組中是否包含人參屬中藥材特有ITS2序列，完成中成藥內人參屬中藥材的鑒定。

10.如權利要求9所述方法，其特征在于，步驟(1)中，人參屬特異產物長度為416bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

優選的，步驟(1)中，提取中成藥的混合基因組，然后使用基因組純化試劑盒，對提取的混合基因組進行純化；

優選的，步驟(1)中，PCR擴增體系如下：

優選的，步驟(1)中，PCR擴增程序如下：

95℃預變性10min；95℃變性15s，41℃退火15s，72℃延伸30s，33個循環；72℃終延伸5min，然后12℃靜置12h；

根據本發明優選的，步驟(2)中，PCR擴增體系如下：

優選的，步驟(2)中，PCR擴增程序如下：

98℃預變性3min；98℃變性10s，48℃退火15s，72℃延伸10s，30個循環；72℃終延伸5min，然后12℃靜置12h；

優選的，步驟(2)中，將質粒轉染到DH5α感受態細胞并涂布于具有抗性的LB固體培養基上，使其形成單克隆，完成ITS2混合序列的分離；

優選的，步驟(2)中，LB固體培養基的抗性為卡那霉素；

優選的，步驟(3)中，在步驟(2)中挑取一定數量單克隆，將它們分別接種于具有抗性的LB液體培養基中；隨后將該液體培養基置于35-37℃的搖床內，在轉速180-200rpm的條件下搖動過夜，獲得液體培養物；

優選的，步驟(3)中，挑取的單克隆數量為15-20個；

優選的，步驟(3)中，LB液體培養基的抗性為卡那霉素；

優選的，步驟(3)中，應用SeqMan與Chromas軟件對測序結果進行拼接校對，產物長度為：拼接后的序列長度為200-400bp；Q值為：拼接校對后產物的平均Q值30；

優選的，步驟(3)中，比對數據庫為NCBI的在線核苷酸序列數據庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastnPAGE_TYPE＝BlastSearchLINK_LOC＝blasthome)和ITS2在線數據庫(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)；

優選的，所述方法中，所述人參屬中藥材為三七和/或人參；

優選的，ITS2通用上游引物為SEQ ID NO.4，ITS2通用下游引物為SEQ ID NO.5。