[發明專利]一種基于NGS的CNV分析檢測腦膠質瘤染色體的方法

在審

• 申請號: 202110563064.2
• 申請日: 2021-05-24
• 公開（公告）號: CN113355401A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 李唐建
• 申請（專利權）人: 闊然生物醫藥科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種基于NGS的CNV分析檢測腦膠質瘤染色體的方法，優化適合于腦膠質瘤檢測的WES探針設計，尤其是優化了7號和10號染色體的探針設計，保證高捕獲率，高覆蓋率；通過DNA提取試劑盒提取腫瘤樣本的DNA，然后使用Illumina建庫試劑盒建庫；通過Illumina測序儀測序,下機的fastq數據經過Trimmomatic處理，主要對接頭序列和低質量序列進行過濾；本發明基于NGS的全外顯子組測序的拷貝數變異分析技術檢測腦膠質瘤第7號染色體獲得和第10號染色體缺失（+7/?10）使得能利用二代測序一次性對膠質瘤IDH、+7/?10、TERT、EGFR、ATRX和TP53等分子標志物進行檢測，降低了時間成本和費用，降低了檢測對DNA樣本的要求、提高檢測的靈敏度。

技術領域

本發明涉及腦膠質瘤染色體的檢測領域，具體為一種基于NGS的CNV分析檢測腦膠質瘤染色體的方法。

背景技術

目前常用于檢測腦膠質瘤+7/-10染色體缺失的技術方法主要有：FISH技術、Karyotype Analysis技術、CMA技術、熒光實時定量PCR 檢測技術。

FISH技術即原位雜交技術，該技術的原理是利用熒光標記的特異核酸探針與細胞內相應的靶DNA分子或RNA分子雜交，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號，來確定與特異探針雜交后被染色的細胞或細胞器的形態和分布，或者是結合了熒光探針的DNA區域或RNA分子在染色體或其他細胞器中的定位。該技術需要+7/-10探針，試驗流程是：樣本準備-脫蠟-預處理-消化-沖洗-雜交-洗滌-DAPI染色。值得一提的是，該技術是檢測膠質瘤+7/-10染色體拷貝數變化情況的金標準。

Karyotype Analysis技術即染色體核型分析技術，是以分裂中期染色體為研究對象，也稱之為，根據染色體的長度、著絲點位置、長短臂比例、隨體的有無等特征，并借助顯帶技術對染色體進行分析、比較、排序和編號，根據染色體結構和數目的變異情況來進行診斷。多年來，染色體核型分析技術一直被認為是確診染色體畸變的“金標準”，也是染色體病產前診斷的一線方法，550條帶分析分辨率可達到5M，該方法也可以用于檢測膠質瘤+7/-10染色體拷貝數變化情況。

CMA技術即染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)技術，又被稱為“分子核型分析”，能夠在全基因組水平進行掃描，可檢測染色體不平衡的拷貝數變異(copy number variant，CNV)，尤其是對于檢測染色體組微小缺失、重復等不平衡性重排具有突出優勢。根據芯片設計與檢測原理的不同，CMA技術可分為兩大類：基于微陣列的比較基因組雜交(array．based comparative genomic hybridization，aCGH)技術和單核苷酸多態性微陣列(single nucleotide polymorphism array．SNP array)技術。前者需要將待測樣本DNA與正常對照樣本DNA分別標記、進行競爭性雜交后獲得定量的拷貝數檢測結果，而后者則只需將待測樣本DNA與一整套正常基因組對照資料進行對比即可獲得診斷結果。通過aCGH技術能夠很好地檢出CNV，而SNP array除了能夠檢出CNV外，還能夠檢測出大多數的單親二倍體(uniparental disomv，UPD)和三倍體，并且可以檢測到一定水平的嵌合體。而設計涵蓋CNV+SNP檢測探針的芯片，可同時具有CNV和SNP芯片的特點，該方法也可以用于檢測膠質瘤+7/-10染色體拷貝數變化情況。

熒光實時定量PCR 檢測技術作為較早出現的檢測目的區段DNA 拷貝數的方法，主要可以通過檢測PCR 反應體系中的熒光強度來實現對初始樣品的某個DNA 片段的拷貝數進行定量。最為常用的方法是通過SYBR Green 嵌入DNA 雙鏈發光原理來實現對DNA 的定量，然后運用已知為2 拷貝的DNA 標準品作為內參校正， 從而對目的DNA 片段的拷貝數進行確認，該方法也可以用于檢測膠質瘤+7/-10染色體拷貝數變化情況。