[發明專利]人類皰疹病毒的病原體核酸檢測引物探針組合、試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202110546303.3
• 申請日: 2021-05-19
• 公開（公告）號: CN113122660B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發明（設計）人: 馮志山;高源;趙夢川;李貴霞;帖彥清
• 申請（專利權）人: 馮志山
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 張柳

本發明涉及微生物及核酸基因組檢測領域，具體涉及提供利用等溫核酸擴增技術對臨床上一種常見的人類皰疹病毒(巨細胞病毒)核酸檢測的引物組合和探針。本發明提供的引物組合與探針，特異性好，靈敏度高。

技術領域

本發明涉及微生物及核酸基因組檢測領域，特別涉及人類皰疹病毒的病原體核酸檢測引物探針組合、試劑盒及其應用。

背景技術

巨細胞病毒(Cytomegalvirus，CMV)是人類皰疹病毒家族中的雙鏈DNA病毒，可引起原發性和復發性疾病，嚴重危害人類的生命和健康，特別是在免疫力低下和器官移植的患者中。巨細胞病毒感染與人類先天性疾病高度相關，易導致新生兒生長遲緩、神經性耳聾、先天性耳聾等疾病。CMV、人類皰疹病毒以及其他相關病毒都可以引起呼吸道疾病、神經性感染和傳染性單核細胞增多癥以及其他臨床疾病。這些種病原體引起的疾病的臨床癥狀非常相似。

目前，對CMV感染的病原學鑒定主要包括病毒培養、血清學檢測和分子生物學檢測。病毒培養是病原體診斷的金標準，但耗時長，樣本要求質量高，不利于傳染病的早期診斷；血清學檢測也有一些缺點，如耗時長、窗口期不穩定。定量聚合酶鏈反應(QuantitativePolymerase chain reaction,qPCR)逐漸成為核酸檢測的金標準。然而，高精度的復雜設備和專業人員在基層應用中難度較大，因此有必要開發一種簡單、快速、方便、適用的核酸檢測方法。

重組酶介導的等溫核酸擴增技術(Recombinase-aided amplification，RAA)已被成功應用于2019年新型冠狀病毒、乙型肝炎病毒、腸道病毒、人腺病毒、呼吸道合胞病毒、百日咳桿菌等病原體的檢測，以及人類先天性心臟病的單核苷酸多態性分型。該技術在體外最適溫度為37-42℃的條件下，利用反應體系中的大腸桿菌重組酶UvsX、單鏈結合蛋白、DNA聚合酶、緩沖液等反應組分，可在30分鐘內實現目的基因的指數化擴增。整個過程包括引物和同源序列的緊密結合，以及鏈的延伸和互補。

內部質控(internal control，IC)包括競爭性內參(Competitive IC,CIC)和非競爭性內參(Noncompetitive IC，NCIC)，是核酸檢測反應的一個重要的體系監控，在RAA反應中引入IC，實時監測整個RAA反應以此避免假陰性的出現。競爭性內參是目的基因和內部指控共享同一對正向和反向引物，在封閉的單管中分別引入特異的與靶序列和內參序列互補的探針，實時監測整個RAA反應系統。結果顯示CIC為陽性時，表明結果可靠真實，而CIC為陰性時，指示結果失效，可能的原因是操作失誤、溫度不當、RAA反應體系混合物不正確、DNA聚合酶活性差或樣品基質中存在抑制物質，從而導致了假陰性結果。非競爭性內參，是使用不同的引物對對靶基因和內部指控進行擴增，其來源于樣本中的人類基因組，目的是對核酸提取到結果判讀整個過程進行實時監控，不僅對擴增反應進行監控，還能夠對樣本采集質量和核酸提取質量進行解釋。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了人類皰疹病毒(巨細胞病毒)的病原體核酸檢測引物探針組合、試劑盒及其應用。本發明提供的引物組合與探針，特異性好，靈敏度高。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了引物探針組合，包括第一引物探針組合和/或第二引物探針組合；

所述第一引物探針組合為CIC組合，具有：

(I).上游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；和

(II).下游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和

(III).探針具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；或

(IV).如(I)、(II)和/或(III)所示的核苷酸序列經取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且與(I)、(II)和/或(III)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或