[發明專利]一種表達A型塞內卡病毒結構蛋白的方法

有效

• 申請號: 202110515657.1
• 申請日: 2021-05-12
• 公開（公告）號: CN113248574B
• 公開（公告）日: 2023-06-13
• 發明（設計）人: 鄭海學;茹毅;伍春平;馬坤;劉華南;張貴財;郝榮增;李亞軍;李丹;劉永杰;楊帆;田宏;張克山;曹偉軍;劉湘濤
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C07K14/085
• 分類號: C07K14/085;C12N15/70;C12N15/62;C07K1/22;A61K39/125;A61P31/14
• 代理公司: 北京力量專利代理事務所(特殊普通合伙) 11504
• 代理人: 戴治娟

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種高效表達A型塞內卡病毒結構蛋白的方法。本發明首先對編碼A型塞內卡病毒三種結構蛋白VP0、VP3和VP1的基因進行原核表達密碼子優化，并借助小泛素樣融合蛋白，獲得了在大腸桿菌中同時可溶性表達三種結構蛋白的單個質粒；其次，在大腸桿菌中轉入分子伴侶質粒和上述A型塞內卡病毒結構蛋白質粒，進一步提高了A型塞內卡病毒結構蛋白的可溶性表達，并解決了目標蛋白表達量不均一的問題，獲得的目標蛋白約占菌體總蛋白25％以上；由表達獲得的三種結構蛋白配制獲得的塞內卡病毒病亞單位疫苗，能夠激發豬體產生較高水平的中和性抗體，對國內A型塞內卡流行毒具有良好的保護作用。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種高效表達A型塞內卡病毒結構蛋白的方法。

背景技術

A型塞內卡病毒(Senecavirus?A，SVA)也稱塞內卡病毒(Seneca?Valleyvirus，SVV)，屬于小RNA病毒科、塞內卡病毒屬，其基因組為單鏈正股RNA，基因組長度約為7.2kb。SVA唯一的開放閱讀框(ORF)用于編碼多聚前體蛋白，具有小RNA病毒典型的L-4-3-4結構，包含L前體蛋白及結構蛋白的P1區和非結構蛋白的P2區和P3區，P1區蛋白在病毒2A、3C蛋白酶和宿主蛋白酶水解下可產生3種結構蛋白和7種非結構蛋白。VP0、VP1和VP?3作為病毒衣殼的表面結構蛋白具有良好的免疫原性。

SVA最初被認為是細胞培養過程的污染物，推測其來源于豬的胰酶或胎牛血清。2007年SVA被發現是引起加拿大發生的豬原發性水皰病(PIVD)的致病病原，SVA感染豬后引起鼻吻部、蹄部冠狀帶出現明顯水泡，同時伴有跛行、厭食、嗜睡和發燒等臨床癥狀，與口蹄疫癥狀無法區分，困擾口蹄疫防控，嚴重危害養豬業發展。盡快研發疫苗成為防控該病大范圍流行最迫切、有效的方法。

塞內卡滅活疫苗是塞內卡田間毒株經病毒培養系統大量擴增、滅活、乳化等工藝制成，具有良好的免疫保護效果。但是，傳統的滅活疫苗在生產制備過程中存在因病毒滅活不徹底而散毒的風險、生產成本較高等問題，亟需研制更加安全、有效的新型塞內卡病毒疫苗。

塞內卡病毒結構蛋白負責組裝病毒衣殼，決定抗原特異性，是病毒重要的抗原成份。與小RNA病毒科的其它病毒相似，塞內卡病毒三種結構蛋白VP0、VP3和VP1在體外混合后，一部分會自行裝配形成空衣殼(病毒樣顆粒)，其形態、結構與真實病毒粒子相同或相似，保有病毒粒子空間構象，但不含病毒核酸，無法進行復制，也不具有感染性。塞內卡病毒空衣殼含有病毒的特異性抗原表位，能模擬天然病毒被宿主抗原提呈細胞的識別過程，有效刺激機體產生很強的免疫應答，是更加安全有效的疫苗候選者。但是，相較于其他小RNA病毒科病毒(口蹄疫病毒)的病毒空衣殼，提高塞內卡病毒空衣殼的產率和純度相對比較困難，即使采用制備其他小RNA病毒科病毒(口蹄疫病毒)空衣殼的相同體系，仍然無法提高塞內卡病毒空衣殼的產率和純度。

目前通過基因工程技術，利用大腸桿菌表達系統制備塞內卡病毒空衣殼已有文獻報道。大腸桿菌表達系統具有成本低、細胞生長快、可規模放大等特點，但其表達產物易形成包涵體，導致生物活性較差，而獲得的目的蛋白的純度較低。因此提高SVA結構蛋白的表達純化量十分必要。有研究表明，在大腸桿菌表達系統中，通過將不同融合標簽結合使用，可以提高目的蛋白的表達量和病毒樣顆粒的組裝效率，例如專利(CN108642021B)公開了在A型塞內卡病毒結構蛋白VP0、VP1、VP3中引入SUMO，分別構建了VP0、VP1、VP3的表達質粒，并在SUMO?VP1基因的N端再次融合GST得VP1重組載體，并與VP0和VP3的表達質粒共同轉染的表達菌表達。但是分別構建多個表達質粒、借助多種融合蛋白、通過多種抗性篩選工程菌株步驟較為復雜。也有研究表明分子伴侶能夠提高目的蛋白的可溶性表達，例如文獻(A型口蹄疫結構蛋白VP1可溶性表達及O型口蹄疫結構蛋白的融合表達[D]，崔穎磊)公開了使用分子伴侶促進A型口蹄疫結構蛋白VP1可溶性表達的策略，但是分子伴侶促進目的蛋白可溶性表達的結果也存在一定的隨機性，相反可能會抑制其他酶或蛋白的可溶性表達；而且在蛋白純化過程中分子伴侶污染現象嚴重。

發明內容