[發明專利]釀酒酵母工程菌及其在制備原兒茶酸中的應用

有效

• 申請號: 202110494864.3
• 申請日: 2021-05-07
• 公開（公告）號: CN113201466B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 元英進;李炳志;張仁寬
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P7/42;C12R1/865
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 王歡

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及釀酒酵母工程菌及其在制備原兒茶酸中的應用。本發明在敲除了ADH6、ADH7、BDH2基因的釀酒酵母的基礎上，轉入外源基因4CL、ECH、vdh、vanA、vanB、metf1、ligM中的至少一種；過表達內源基因MET6；和/或，敲除內源基因MHT1、SAM4中的至少一種，在酵母體內構建了一種新的木質素生物轉化路徑，該路徑通過以上基因的改造調控四氫葉酸代謝強化菌株脫甲基作用促進香草酸轉化合成原兒茶酸，實現了利用木質素單體及木質素合成原兒茶酸。不僅可以解決木質素的利用問題，而且可以生成原兒茶酸這種重要的化工原料，實現木質素的高值化利用。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及釀酒酵母工程菌及其在制備原兒茶酸中的應用。

背景技術

木質素是第二種天然聚合物，在大多數陸地植物中含量為干重的15％至40％(Ragauskas et al.，2014)。全球制漿造紙工業木質素年產量約5000萬噸。然而，98％的木質素用于能源生產的燃燒或填埋場的處置，對環境造成嚴重威脅(Garlapati等人，2020)。在自然界中，存在著一些能夠降解木質素的微生物，這些微生物可以將木質素轉化利用，生產各種產品。最近，通過降解和轉化木質素，在工程木質素降解微生物中產生了諸如黏康酸(MA)和聚羥基烷酸酯(PHA)和油脂等化學品(KosaRagauskas，2013；Lin et al.，2016；Liuet al.，2019；Mycroft et al.，2015；Salvachúa et al.，2018)。然而，如果木質素的苯環結構得不到有效利用，會造成資源的浪費。通過木質素苯環結構的轉化，不同木質素單體底物可以轉化為重要的芳香產物，，如原兒茶酸或兒茶酚的生物合成。原兒茶酸，作為藥物，在臨床上可用于治療慢性氣管炎、燒傷、小兒肺炎、菌痢、急性盂腎炎、急性胰腺炎及某種潰瘍病的治療。另外，其具有一定的抗氧化抗菌作用，對金黃葡萄球菌，沙門氏菌，大腸桿菌等有抑制作用。原兒茶酸是一種關鍵的代謝中間體，可以進一步轉化為許多化學物質，如己二酸，吡啶2,4-二羧酸等。此外，在最近的研究中，原兒茶酸可以用做合成聚合物的單體。因此原兒茶酸具有廣闊的應用前景。由木質素合原兒茶酸進行了初步的研究，木質素單體阿魏酸通過表達棒狀桿菌NBRC100395的香草酸O-脫甲基酶基因(vanAB)在谷氨酸梭菌中產生原兒茶酸(Okai等人，2017)。然而，原兒茶酸通常通過多種木質素降解途徑被木質素降解微生物同化為碳源(Clarkson et al.，2017)。因此，對木質素降解菌進行代謝工程研究，減少原兒茶酸的降解是十分必要的。敲除Rhodococcus jostii RHA1中的pcaHG可在6天培養中從木質素中產生原兒茶酸(Ramachandran et al.，2020)。除木質素降解微生物外，模式生物大腸桿菌表達香蘭素脫氫酶(ligV)、香蘭素O-脫甲基酶(ligM)和原兒茶酸脫羧酶(aroY)，它們從木質素解聚產物的香蘭素中產生原兒茶酸和兒茶酚(Wu et al.，2017；Wu et al.，2018)。然而，工程大腸桿菌菌株在轉化過程中大量積累了中間香草醛酸。這表明香草酸O-脫甲基酶是脫甲基過程中的一個瓶頸，需要對其進行優化以盡量減少香草酸的積累提高木質素轉化效率。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了釀酒酵母工程菌及其在制備原兒茶酸中的應用。本發明在釀酒酵母菌株的基礎上進行基因改造，在酵母體內構建了一種新的木質素生物轉化路徑，獲得的釀酒酵母工程菌可以充分利用木質素及其衍生的芳香族化合物制備原兒茶酸，明顯提高了原兒茶酸的含量。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供的釀酒酵母工程菌，以釀酒酵母菌株為底盤菌株，并進行如下改造：

a)轉入外源基因4CL(4-香豆酸輔酶A連接酶)、ECH(烯酰CoA水合酶)vdh(香草醛脫氫酶)、vanA、(香草酸脫甲氧基酶亞基A)vanB(香草酸脫甲氧基酶亞基B)、metf1(5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶)、ligM(香草酸脫甲氧基酶)中的至少一種；

b)過表達內源基因MET6；