[發明專利]ZmFhb1蛋白及其編碼基因在提高玉米穗腐病抗性中的應用

有效

• 申請號: 202110473451.7
• 申請日: 2021-04-29
• 公開（公告）號: CN113150096B
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發明（設計）人: 劉昌林;謝傳曉;徐云碧;李新海;朱金潔;祁顯濤;黃長玲;黎亮
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院作物科學研究所
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/29;C12N15/113;C12N15/84;C12N15/55;A01H5/00;A01H5/10;A01H6/46
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 張璐

本發明涉及植物基因工程技術領域，具體涉及ZmFhb1蛋白及其編碼基因在提高玉米穗腐病抗性中的應用。本發明首次發現，通過抑制ZmFhb1蛋白的編碼基因的表達，可以顯著提高玉米對穗腐病的抗性。本發明所提供的sgRNA和CRISPR/Cas9敲除載體可以顯著提高CRISPR/Cas9敲除載體的特異打靶效率，進而有利于提高玉米基因Fhb1基因的敲除效率。同時，按照本發明的方法可以快速創制抗穗腐病的玉米種質，進而能降低該病對玉米種植的影響。

技術領域

本發明涉及植物基因工程技術領域，具體涉及ZmFhb1蛋白及其編碼基因在提高玉米穗腐病抗性中的應用。

背景技術

基因組編輯是一種對基因組進行定向精確修飾的技術，主要包括鋅指核酸酶(Zinc-Finger Nucleases，ZFNs)，類轉錄激活因子效應物核酸酶(TranscriptionActivator-Like Effector Nucleases，TALENs)和規律成簇的間隔短回文重復系統(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associatednuclease，CRISPR/Cas)。CRISPR/Cas系統大致分為I型、II型和Ⅲ型3類，其中II型系統的組成比較簡單，只需要Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA 3種成分即可發揮作用，且具有高效性和易操作性，成為目前應用最廣泛的基因組編輯系統。II型CRISPR/Cas系統的特征蛋白為Cas9，Cas9蛋白具有RuvC和HNH兩個核酸酶結構域,該結構域負責切割靶DNA的兩條鏈，從而造成靶DNA雙鏈斷裂。其中HNH結構域負責切割與crRNA互補的DNA鏈，切割位點位于原型間隔序列毗鄰基序(Protospacer adjacent motif,PAM)上游3bp處，RuvC結構域則負責切割非互補鏈，切割位點位于PAM上游3–8bp處。Cas9蛋白同時具有加工產生crRNA以及切割外源核酸的功能。crRNA通過堿基配對與tracrRNA結合形成tracrRNA/crRNA復合物，研究者可以將tracrRNA和crRNA作為兩種向導RNA(gRNA)或者將兩者融合在一起形成單向導RNA(single guide RNA,sgRNA)。sgRNA能夠與Cas9核酸內切酶結合并將Cas9引導至基因組上對靶位點進行切割。CRISPR/Cas9系統使目標基因DNA產生雙鏈斷裂，激活細胞內的DNA損傷修復機制，進而產生缺失、敲入等變異。目前，CRISPR/Cas9系統已被迅速地用于擬南芥、煙草、高粱、水稻、小麥、玉米等不同植物基因組的定向編輯研究中，并且獲得了較高的誘導突變率和可穩定遺傳的基因組編輯植株。

玉米(Zea mays L.)是重要的糧食和飼料作物，也是現代食品和化學工業的原料，在我國農業生產和經濟發展中占有重要地位。玉米穗腐病又稱赤霉病，是全球玉米種植區廣泛發生的真菌性病害。目前，已報道的引起玉米穗腐病的病原多達20多種，包括禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)、輪枝鐮孢菌(Fusarium verticillioides)、草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)、黃曲霉菌(Aspergillus flavus)、綠色木霉菌、串株鐮刀菌、青霉菌(Penicillium spp.)、枝孢菌(Cladosporium spp.)等。上述病原即可侵染玉米果穗，也可以侵染籽粒，并可以產生有毒代謝產物如伏馬毒素、黃曲霉毒素等，嚴重危害人、家畜、家禽的健康。其中，禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)、輪枝鐮孢菌(Fusariumverticillioides)等病原既可以侵染玉米，也可以侵染小麥。玉米果穗發生穗腐病后，常出現粉紅色、暗褐色或白色霉層，即病原菌的菌體、分生孢子梗和分生孢子，多雨或濕度大時可擴展到整個雌穗。病菌分生孢子借風雨傳播，在15-28℃、相對濕度75％以上的條件下易侵染流行。發病籽粒無光澤，不飽滿，質脆，內部空虛，百粒重顯著降低。病菌在種子、病殘體或土壤中越冬，成為第二年的侵染源。玉米籽粒在庫存時，如果含水量偏高、庫內溫度升高，也會腐爛或發病。玉米穗腐病的防治要以選用抗病品種為基礎，重要時期施藥防蟲防病。

發明內容