[發(fā)明專利]一株分泌苯海拉明單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用

有效

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• 申請日: 2021-04-27
• 公開（公告）號: CN113151188B
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發(fā)明（設計）人: 胥傳來;劉杰;匡華;劉麗強;宋珊珊;胡擁明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;C07K14/77;C07C233/18;C07C231/02;C07C231/24;G01N33/577;G01N33/53;C12R1/91
• 代理公司: 無錫華源專利商標事務所(普通合伙) 32228
• 代理人: 嚴梅芳

一株分泌苯海拉明單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，屬于化妝品安全免疫檢測領域。本發(fā)明分泌苯海拉明單克隆抗體的雜交瘤細胞株SHS 5B11，分類命名為單克隆細胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏編號CGMCCNo.20787。此細胞株分泌的單克隆抗體，對苯海拉明具有較好的特異性和檢測靈敏度。本發(fā)明合成了苯海拉明完全抗原，并將它與等量弗氏佐劑混合乳化，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過間接競爭酶聯(lián)免疫法的篩選和三次亞克隆，得到雜交瘤細胞株SHS 5B11。此細胞株分泌的單克隆抗體，對苯海拉明具有較好的檢測靈敏度(IC₅₀值為2.93ng/mL)，可以用于化妝品中苯海拉明的殘留檢測。

技術領域

本發(fā)明涉及一株分泌苯海拉明單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，屬于化妝品安全免疫檢測領域。

背景技術

苯海拉明是一種抗組胺藥，被廣泛應用于醫(yī)藥領域，對皮膚瘙癢、過敏性鼻炎、蕁麻疹和接觸性皮炎等過敏反應有良好效果。苯海拉明能起到殺菌、祛痘作用，并有一定的抗過敏效果，因此可能被添加于祛痘化妝品中以達到祛痘功效。由于化妝品所使用的原料或工藝流程中的丙二醇等物質(zhì)能促進人體對苯海拉明的吸收，當人體內(nèi)苯海拉明含量過高，會使中樞神經(jīng)受到較強抑制，導致人體產(chǎn)生嗜睡、頭暈、頭痛、惡心、嘔吐及上腹部不適等癥狀。我國《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》及歐盟化妝品法規(guī)明確規(guī)定苯海拉明為化妝品中的禁用物質(zhì)。目前，苯海拉明檢測方法主要為儀器檢測，常用的有氣相色譜法、液相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法。盡管這些基于色譜的方法具有很高的靈敏度和特異性，但也存在一些缺點，例如需要徹底的樣品凈化，高溶劑消耗，昂貴的設備以及熟練的技術人員。因此，需要一種快速，簡單的分析苯海拉明殘留物的方法。

酶聯(lián)免疫法(ELISA)是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時對樣本的前處理簡單、純化步驟少、分析容量大、檢測成本低而且操作簡便，適用于大量樣本的現(xiàn)場快速檢測，因此在化妝品禁用物質(zhì)分析中得到了廣泛應用。而使用酶聯(lián)免疫法檢測苯海拉明的前提是得到對苯海拉明具有高特異性和高靈敏度的單克隆抗體，因此，找到一種制備對苯海拉明具有高特異性和高靈敏度的單克隆抗體的方法十分關鍵。發(fā)明人嘗試通過雜交瘤細胞制備苯海拉明單克隆抗體，但在制備能分泌苯海拉明單克隆抗體的雜交瘤細胞株的過程中，如何制備苯海拉明半抗原和苯海拉明完全抗原、如何使小鼠產(chǎn)生強免疫，還需進一步的研究；如何使得制備出的雜交瘤細胞株能夠成功分泌出苯海拉明單克隆抗體，還需進一步的研究；如何使得分泌出的苯海拉明單克隆抗體特異性強、靈敏度高，也還需進一步的研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供分泌苯海拉明單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用。此雜交瘤細胞株分泌的苯海拉明單克隆抗體對苯海拉明具有較好的檢測靈敏度(IC₅₀值為2.93ng/mL)，可以用于建立苯海拉明的免疫學檢測方法，檢測化妝品中是否含有苯海拉明。

本發(fā)明的技術方案如下：一株分泌苯海拉明單克隆抗體的雜交瘤細胞株SHS5B11，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，分類命名為單克隆細胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏編號CGMCC No.20787。

本發(fā)明提供了上述一種分泌苯海拉明單克隆抗體的雜交瘤細胞株的制備方法，包含如下步驟：

(1)制備苯海拉明半抗原及苯海拉明完全抗原，將獲得的苯海拉明完全抗原制備成弗氏佐劑與不完全弗氏佐劑；

(2)將得到的弗氏佐劑通過背部皮下注射，注射進入BALB/c小鼠體內(nèi)進行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐劑，加強免疫采用不完全弗氏佐劑；

(3)將經(jīng)過上述免疫過程的小鼠進行采血，通過間接ELISA檢測小鼠血清免疫效價和免疫抑制能力，篩選出血清中苯海拉明抗體含量高的獲得免疫的小鼠；

(4)將篩選出的小鼠用不完全弗氏佐劑再進行最后一次加強免疫，然后通過腹腔注射進行沖刺免疫，沖刺免疫采用不含弗氏佐劑的苯海拉明完全抗原進行；