[發明專利]一種不合成腸桿菌共同抗原和鞭毛的基因工程菌及其應用

在審

• 申請號: 202110455218.6
• 申請日: 2021-04-26
• 公開（公告）號: CN113106049A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 王小元;喬君;檀昕;任泓宇;尹洪辰;胡曉清;李燁
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/62;C12P13/08;C12P21/00;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種不合成腸桿菌共同抗原和鞭毛的基因工程菌及其應用，屬于基因工程和發酵工程領域。本發明在大腸桿菌中敲除大腸桿菌基因組上ECA和鞭毛基因簇的62個基因得到突變菌WQM021，WQM022菌株在營養缺乏(M9)培養基中生長變快，菌體總量增多。采用本發明的方法，WQM022/pBHR68的DCW，PHB濃度和轉化效率進一步提高，分別達到3.03g/L，78.95％，15.78％；重組菌株WQM022/pFW01?thrA*BC?rhtC；該菌株每小時L?蘇氨酸產量，葡萄糖轉化效率和L?蘇氨酸產量分別達到1.83g/L，11.42％，0.63g/h。

技術領域

本發明涉及一種不合成腸桿菌共同抗原和鞭毛的基因工程菌及其應用，屬于基因工程和發酵工程領域。

背景技術

在所有腸桿菌科菌株中發現的腸桿菌共同抗原(ECA)存在三種不同的形式：甘油磷脂結合型、脂多糖核結合型和環型。ECA的生物合成和組裝由一個基因簇編碼。ECA具有保守的重復單元結構，由三個氨基糖組成：N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰-D-甘露糖醛酸和4-乙酰氨基-4,6-二脫氧-D-半乳糖。ECA在細胞膜完整性、鞭毛的生成、有機酸耐受性和細胞膜通透性等方面具有多種細胞功能。ECA也是一種毒力因子，在食品領域可能加速產品變質和病原菌群污染，增加醫療領域的治療難度和感染風險。此外，ECA的生成可能會消耗細菌的能量和底物，這些能量和底物本應更好地用于促進細胞生長或代謝產物的產生。此外，位于外膜和周質間隙的ECA可阻礙物質交換和膜通透性，導致營養限制或工業發酵微生物生長緩慢。細菌鞭毛是另一種生物膜結構，既是運動細胞器，又是蛋白質輸出/組裝裝置。鞭毛負責生物膜的形成、運動和趨化。此外，鞭毛介導的運動是導致發展中國家旅行者和兒童腹瀉的一個關鍵毒性特征。

聚羥基丁酸酯(PHB)是一種廣泛存在于微生物中的天然高分子生物材料。PHB在細胞內以不溶性球形包裹體或PHB顆粒的形式存在，作為生物體內的碳源和儲能物質。PHB具有良好的生物相容性、生物降解性和熱加工性，可作為生物醫用材料和生物降解包裝材料。據報道，截斷脂多糖結構可以重新平衡碳和氮代謝，導致PHB的產量顯著增加。目前，PHB的研究主要集中在生物合成途徑的修飾、廉價原料的開發和利用以及PHB的再生和改性等方面。L-蘇氨酸是一種必需氨基酸，廣泛應用于醫藥、化學試劑、食品強化劑和飼料添加劑中。L-蘇氨酸已通過微生物發酵工業化生產。L-蘇氨酸的生物合成與TCA途徑競爭，需要大量的能量來源，這是L-蘇氨酸高產的瓶頸。L-蘇氨酸的研究熱點主要集中在代謝途徑修飾上，如脂肪酸阻斷、磷酸轉移酶系統和底物再分配。

PHB和L-蘇氨酸目前依然存在產量不高，生產工藝復雜，生產成本高的問題，如何解決這些問題，成為目前研究的熱點和難點。

發明內容

技術問題：

本發明要解決的技術問題，是提供一種能夠提高產物產量的底盤細胞的構建方法；同時提供一種能夠提高產物產量的基因工程菌及其構建方法和應用。

技術方案

為了解決上述技術問題，發明人課題組考慮到ECA在大腸桿菌K-12亞群中不同領域的不良影響較多，MG1655菌株通過基因工程手段敲除所有12個參與ECA生物合成的基因，構建了ECA缺陷型WQM021，并隨機選取了3種不同的產物：mCherry蛋白(蛋白質類)、PHB(碳源類)和L-蘇氨酸(氨基酸類)，考察WQM021對發酵產品生產的促進作用。結果表明，去除ECA可以促進細胞在LB和M9培養基中的增長，促進PHB和L-蘇氨酸的生產，并促進mCherry蛋白的生產和胞外分泌。最后，根據WQM021的代謝分析，鞭毛合成基因被進一步從WQM021中敲除，獲得ECA和鞭毛雙缺失的突變株WQM022。研究發現，WQM022可以合成更多的PHB和L-蘇氨酸，并進一步促進mCherry蛋白的生產和胞外分泌。因此，WQM021和WQM022具有作為優秀的底盤菌株的應用潛力，同時也表明，通過去除微生物非必需的膜壁結構，不僅能減少致病性風險，還可以將節約的底物和能量用于發酵產物的合成，這對其他工業微生物的優化和轉化具有特殊的指導意義。