[發明專利]一種水蛭纖溶活性蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 202110449852.9
• 申請日: 2021-04-25
• 公開（公告）號: CN113073093A
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 姜秋;張永清;王玲娜
• 申請（專利權）人: 山東中醫藥大學
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;A61K38/48;A61P7/02
• 代理公司: 濟南克雷姆專利代理事務所(普通合伙) 37279
• 代理人: 楊婷

本發明屬于醫藥領域，具體涉及一種水蛭纖溶活性蛋白及其制備方法。本發明將水蛭干品粉碎后加丙酮與水的混合溶液提取，然后通過乙醇沉淀，獲得水蛭纖溶活性蛋白。本發明操作步驟簡單，在保證獲得纖溶活性蛋白的同時，最大限度降低了提取組分中色素、雜蛋白含量，所述的水蛭纖溶活性蛋白活性強，對纖維蛋白有明顯的溶解作用，溶栓率大大提高，在制備溶栓藥物中有很大的開發應用前景。

技術領域

本發明屬于醫藥領域，具體涉及一種水蛭纖溶活性蛋白及其制備方法。

背景技術

血栓性疾病具有發病率、致殘率、致死率高的特點，嚴重威脅著人類健康。隨著人口老齡化加劇及人們生活方式的改變，血栓性疾病將更加嚴重。纖維蛋白不具可溶性，可網絡血細胞等形成血栓，是血栓的主要成分，通過纖溶酶溶解血栓中的纖維蛋白是臨床上治療血栓性疾病安全而有效的手段。目前，臨床上常用的溶栓藥物主要包括尿激酶、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)及其變異體等纖溶酶，存在半衰期較短、價格昂貴等缺點，從而限制了其在臨床中的應用。因此，充分利用豐富的中藥資源，開發、研制新的溶栓藥物仍然十分必要，并有著廣闊的應用前景。

水蛭作為傳統中藥，始載于《神農本草經》，是活血作用最顯著的10種中藥材之一，具有破血逐瘀、通經等功效。隨著水蛭藥材資源的深入開發研究，其單味或復方制劑已廣泛用于血栓性疾病的治療，且效果顯著?，F今，水蛭中的多種活性蛋白多肽類成分一般通過水提取或酶解法獲得，但所提取組分雜質占比較大，活性較差。

發明內容

針對上述問題，本發明提出了一種水蛭纖溶活性蛋白及其制備方法，本發明獲得的水蛭纖溶活性蛋白組分含有雜質少，活性強，對纖維蛋白有明顯的溶解作用；對大鼠體外血栓有溶解作用。

本發明所述的一種水蛭纖溶活性蛋白，通過以下方法制備得到，其具體步驟為：

(1)將水蛭干品粉碎后加丙酮與水的混合溶液，于4-8℃冷浸24h，提取，合并提取液，過濾，得濾液；

(2)將濾液濃縮，得料液I；

(3)向步驟(2)所得料液I中滴加乙醇，使體系中乙醇體積百分數至65％，于4-8℃冷浸過夜，得料液II；

(4)去除料液II中上清液，收集沉淀，加純水溶解并于4-5℃放置2-3h，離心，取上清液冷凍干燥，即可得到水蛭中纖溶活性蛋白。

由于水蛭中纖溶活性成分具有一定的疏水性，只有在一定極性的有機溶劑中才能被有效提取出來，且極性太大提取出來的大多為可溶性色素，而極性太小纖溶活性成分經沉淀后隨雜質除去，發明人通過多次實驗發現當采用丙酮與水的混合溶液且所述丙酮與水的混合溶液中丙酮的體積分數為40％時，可有效避免水蛭中大量色素等雜質被提取出來，步驟(1)中獲得的濾液主要成分為蛋白質。丙酮與水的混合溶液要提前經過預冷至4℃。步驟(1)中，以質量比計，混合溶液：水蛭干品＝5-6:1。

步驟(2)中濾液濃縮后，料液比為1:2。

步驟(3)中加入乙醇的目的是沉淀活性蛋白，除去雜蛋白和其他脂溶性成分。發明人經過多次試驗發現，當體系中乙醇體積百分數至65％時可使活性蛋白沉淀完全，并能最大限度除去雜質。

步驟(4)所述的上清液中含有蛋白和脂溶性成分，沉淀中主要是蛋白質，加入純水溶解的目的是使活性蛋白溶解，并能除去部分不溶性雜質。

所述離心轉速大于10000rpm。

與現有的纖溶活性蛋白相比，本發明操作步驟簡單，在保證獲得纖溶活性蛋白的同時，最大限度降低了提取組分中色素、雜蛋白含量，所述的水蛭纖溶活性蛋白活性強，對纖維蛋白有明顯的溶解作用，溶栓率大大提高，在制備溶栓藥物中有很大的開發應用前景。

具體實施方式

下面通過實施例對本發明作進一步的說明。

實施例1從干水蛭中提取水蛭纖溶活性蛋白