[發(fā)明專利]基于流式細(xì)胞儀和高通量測序技術(shù)聯(lián)用的超微藻檢測方法

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• 申請日: 2021-04-25
• 公開（公告）號: CN112921066A
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何義亮;寧曼;徐崢
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;C12Q1/6895;C12Q1/6869;C12R1/89
• 代理公司: 上海旭誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發(fā)明公開了一種基于流式細(xì)胞儀和高通量測序技術(shù)聯(lián)用的超微藻檢測方法，涉及超微藻檢測技術(shù)領(lǐng)域，包括以下步驟：(1)對流式細(xì)胞儀進(jìn)行參數(shù)設(shè)置和調(diào)整，并調(diào)節(jié)進(jìn)樣速度；將水樣和熒光微球混合進(jìn)樣，調(diào)節(jié)流速，記錄事件數(shù)，計算藻細(xì)胞的濃度；(2)對分選型流式細(xì)胞儀進(jìn)行所述參數(shù)設(shè)置及調(diào)節(jié)，將所述水樣進(jìn)樣，設(shè)置分選模式和分選速度，收集分選后超微藻；(3)對所述分選后超微藻進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后進(jìn)行高通量測序。本發(fā)明綜合運用流式細(xì)胞技術(shù)和高通量測序技術(shù)進(jìn)行方法的互補融合和多功能聯(lián)動，不僅需要水樣少，而且大大提高水體中超微藻檢測的準(zhǔn)確性，從而更好地揭示超微藻的結(jié)構(gòu)特征和生物多樣性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及超微藻檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于流式細(xì)胞儀和高通量測序技術(shù)聯(lián)用的超微藻檢測方法。

背景技術(shù)

將2μm以下的所有自養(yǎng)光合藻類統(tǒng)稱為超微藻(超微浮游植物)，根據(jù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理特性，超微藻可簡單分為超微原核藻和超微真核藻。超微藻是水體中藻種群結(jié)構(gòu)的重要組成部分，由于獨特的生長特性和豐富的物種組成近年來受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，成為水體中微生物構(gòu)成的研究熱點。超微藻在數(shù)量上雖不如傳統(tǒng)的非超微藻，但其對水體初級生產(chǎn)力和群落結(jié)構(gòu)多樣性及穩(wěn)定性等方面貢獻(xiàn)巨大，在一定程度上會對水體的營養(yǎng)狀態(tài)、物質(zhì)構(gòu)成比例與分布產(chǎn)生影響，深入了解超微藻的動態(tài)變化規(guī)律有利于更好的評估水體水質(zhì)質(zhì)量。

對于超微藻的研究，主要存在幾個難點。第一，超微藻細(xì)胞很小，光學(xué)顯微鏡由于放大倍數(shù)和分辨率的限制，無法實現(xiàn)對超微藻的準(zhǔn)確觀測和統(tǒng)計計數(shù)，具有耗時長、人為誤差明顯的缺點。第二，超微藻的很多物種形態(tài)特征不明顯，肉眼無法分辨，無法實現(xiàn)對超微藻的準(zhǔn)確識別；熒光顯微鏡對自發(fā)熒光較弱且混合生長的藻群辨認(rèn)準(zhǔn)確率低，不能反映藻細(xì)胞的生理狀況。第三，大部分超微藻不能直接分離純培養(yǎng)，劃線法等計數(shù)方法的運用受到普遍限制，環(huán)境因子對超微藻的影響作用探究無法通過室內(nèi)模擬對比實驗進(jìn)行。第四，超微藻的細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對脆弱，在分選樣本的保存方面存在困難。第五，目前應(yīng)用于超微藻多樣性研究的靶基因序列主要包括16S rDNA、18S rDNA及葉綠體16S rDNA，還有一些功能基因rbcL，核糖體基因間隔區(qū)ITS1及ITS2等，水樣過濾方法收集藻細(xì)胞后進(jìn)行高通量測序，存在大量異養(yǎng)模版的干擾，目標(biāo)序列比重較低，測序覆蓋度較低。目前，對超微藻進(jìn)行檢測的手段很少，且具有局限性。

針對以上難點，流式細(xì)胞儀和高通量測序技術(shù)的運用為超微藻總量測定和種群識別提供了新方向。流式細(xì)胞儀能對超微藻進(jìn)行計數(shù)和熒光檢測，得到藻細(xì)胞數(shù)量，根據(jù)色素含量及與純培養(yǎng)藻細(xì)胞位置的對照完成藻群識別，但一般只能精確到門級別，需要分子生物學(xué)手段的輔助從而獲得更加準(zhǔn)確的種屬信息。高通量測序技術(shù)作為分子生物學(xué)技術(shù)的一個重要分支，明確不同微生物的注釋信息和相對豐度變化信息，有助于對微生物多樣性及其分布模式進(jìn)行更深入的探究，但針對超微藍(lán)藻和超微真核藻的高通量測序方法還有待進(jìn)一步研究和優(yōu)化。在測序微生物的收集方法上，傳統(tǒng)的水樣過濾方法在很大程度上造成了對環(huán)境中超微藻多樣性的低估，流式細(xì)胞儀的分選功能可有效去除水體中大部分不能自發(fā)熒光的細(xì)菌、真菌等，減少異樣模版的競爭，提高超微藻序列在整個克隆庫中的比例，解決了對超微藻細(xì)胞進(jìn)行有效收集和保存的難題。近年來已有研究嘗試使用流式細(xì)胞儀分選功能進(jìn)行真核藻類的分選，但研究范圍比較局限。

因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種基于流式細(xì)胞儀和高通量測序技術(shù)聯(lián)用的超微藻檢測方法，針對超微藻檢測進(jìn)行方法體系的構(gòu)建和優(yōu)化調(diào)整，流式細(xì)胞儀對超微藻的分選功能可以彌補高通量測序技術(shù)異養(yǎng)細(xì)菌干擾的缺點，而高通量測序技術(shù)鑒定精確到種級別的優(yōu)點可以彌補流式細(xì)胞儀對超微藻識別不精確的問題。通過細(xì)胞大小和熒光分析對藻群變化有個初步認(rèn)識，再利用流式細(xì)胞儀分選目標(biāo)藻群，隨后進(jìn)行高通量測序，更好地揭示超微藻的結(jié)構(gòu)特征和生物多樣性。

發(fā)明內(nèi)容