[發(fā)明專利]基于流式細胞儀和高通量測序技術(shù)聯(lián)用的超微藻檢測方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110447181.2 | 申請日： | 2021-04-25 |
| 公開（公告）號： | CN112921066A | 公開（公告）日： | 2021-06-08 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 何義亮;寧曼;徐崢 | 申請（專利權(quán)）人： | 上海交通大學(xué) |
| 主分類號： | C12Q1/06 | 分類號： | C12Q1/06;C12Q1/6895;C12Q1/6869;C12R1/89 |
| 代理公司： | 上海旭誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31220 | 代理人： | 鄭立 |
| 地址： | 200240 *** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 基于 細胞 通量 技術(shù) 聯(lián)用 超微藻 檢測 方法 | ||
1.一種基于流式細胞儀和高通量測序技術(shù)聯(lián)用的超微藻檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)對流式細胞儀進行參數(shù)設(shè)置，選擇激光器激發(fā)波長488nm和633nm，設(shè)置五個熒光通道FSC、SSC、PE、APC、PC5.5；調(diào)整各通道閾值和電壓值，并調(diào)節(jié)進樣速度；將水樣和熒光微球混合進樣，調(diào)節(jié)流速，記錄事件數(shù)，計算藻細胞的濃度；
(2)對分選型流式細胞儀進行所述參數(shù)設(shè)置及調(diào)節(jié)，將所述水樣進樣，設(shè)置分選模式和分選速度，收集分選后超微藻；
(3)對所述分選后超微藻進行DNA提取和PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后進行高通量測序。
2.如權(quán)利要求1所述的一種基于流式細胞儀和高通量測序技術(shù)聯(lián)用的超微藻檢測方法，其特征在于，所述水樣通過40μm濾網(wǎng)過濾。
3.如權(quán)利要求1所述的一種基于流式細胞儀和高通量測序技術(shù)聯(lián)用的超微藻檢測方法，其特征在于，所述熒光微球的粒徑為2μm。
4.如權(quán)利要求1所述的一種基于流式細胞儀和高通量測序技術(shù)聯(lián)用的超微藻檢測方法，其特征在于，所述進樣速度控制在每秒細胞數(shù)100-1000之間。
5.如權(quán)利要求1所述的一種基于流式細胞儀和高通量測序技術(shù)聯(lián)用的超微藻檢測方法，其特征在于，所述分選模式為Purity-Mode1。
6.如權(quán)利要求1所述的一種基于流式細胞儀和高通量測序技術(shù)聯(lián)用的超微藻檢測方法，其特征在于，所述分選速度為2.0-4.0。
7.如權(quán)利要求1所述的一種基于流式細胞儀和高通量測序技術(shù)聯(lián)用的超微藻檢測方法，其特征在于，所述DNA提取采用E.Z.N.A Water DNA提取試劑盒。
8.如權(quán)利要求1所述的一種基于流式細胞儀和高通量測序技術(shù)聯(lián)用的超微藻檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增選用TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNAPolymerase 20μL反應(yīng)體系。
9.如權(quán)利要求1所述的一種基于流式細胞儀和高通量測序技術(shù)聯(lián)用的超微藻檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增的引物選定雙前向引物A23SrVF1:GGACARAAAGACCCTATG，A23SrVF2：CARAAAGACCCTATGMAGCT和雙逆向引物A23SrVR1:AGATCAGCCTGTTATCC,A23SrVR2:TCAGCCTGTTATCCCTAG。
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