[發(fā)明專利]分析慈姑不同組織的內(nèi)參基因及其篩選方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110429283.1
• 申請(qǐng)日: 2021-04-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113174445B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高美萍;陳清西;江文;謝倩;葉清華;林志城
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣西中知科創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 45130
• 代理人: 牙斐穎

本發(fā)明涉及植物基因技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及分析慈姑不同組織的內(nèi)參基因及其篩選方法和應(yīng)用，本發(fā)明根據(jù)RNA?Seq測(cè)序數(shù)據(jù)分析，利用軟件評(píng)估并分析各個(gè)候選內(nèi)參基因在慈姑不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性，最終篩選出比常用的管家基因更為穩(wěn)定的內(nèi)參基因C36425，該內(nèi)參基因能在慈姑根、莖、葉、花、匍匐莖和球莖中均能穩(wěn)定表達(dá)，最大程度地減小了由于內(nèi)參基因的選擇造成樣品之間和樣品內(nèi)部的差異，為后期利用q RT?PCR探索慈姑生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)功能基因表達(dá)研究提供了科學(xué)依據(jù)。

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及植物基因技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及分析慈姑不同組織的內(nèi)參基因及其篩選方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】

慈姑(Sagittaria sagittifolia L.)是澤瀉科(Alismataceae)慈姑屬宿根性水生草本，原產(chǎn)中國(guó)。歐洲多用于觀賞，中國(guó)、日本、印度和朝鮮用于蔬菜。以球莖作蔬菜食用，為冬春蔬菜供應(yīng)淡季的主要水生蔬菜之一。慈姑含有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，可藥食兼用，具有很大的應(yīng)用市場(chǎng)和開(kāi)發(fā)潛力。種植慈姑已成為農(nóng)民增收經(jīng)濟(jì)來(lái)源，脫貧致富的有效途徑之一。

基因的表達(dá)分析被廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)領(lǐng)域研究。RT-qPCR由于靈敏度高、穩(wěn)定性好，是目前基因表達(dá)分析常用的方法之一。在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行基因表達(dá)分析，選擇最佳內(nèi)參基因是實(shí)現(xiàn)熒光定量PCR結(jié)果準(zhǔn)確性的必要前提，對(duì)于探討基因的表達(dá)情況、基因功能研究等方面起到至關(guān)重要的作用。內(nèi)參基因穩(wěn)定性高，才能準(zhǔn)確地對(duì)目的基因達(dá)進(jìn)行校正。然而內(nèi)參基因的穩(wěn)定性是相對(duì)的，在不同的細(xì)胞類型、試驗(yàn)環(huán)境中，相同的內(nèi)參基因表達(dá)卻不同。

近年來(lái)，植物內(nèi)參基因的篩選已有許多報(bào)道，而對(duì)慈姑在不同試驗(yàn)中內(nèi)參基因的篩選的報(bào)道還較少，也沒(méi)有關(guān)于慈姑不同組織中內(nèi)參基因的報(bào)道。利用實(shí)時(shí)熒光定量方法探究慈姑不同組織下功能基因的差異表達(dá)分析，就需要穩(wěn)定可靠的內(nèi)參因。因此，有必要對(duì)慈姑不同組織部位中內(nèi)參基因進(jìn)行篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

鑒于上述內(nèi)容，有必要挖掘慈菇的內(nèi)參基因，可以很好針對(duì)對(duì)慈姑不同組織部位中內(nèi)參基因進(jìn)行篩選。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

慈姑內(nèi)參基因C36425，所述內(nèi)參基因C36425的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明還包括檢測(cè)所述慈姑內(nèi)參基因C36425的引物對(duì)，所述引物對(duì)其上游序列如序列表SEQ ID NO.2所示，下游序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明還包括所述的慈姑內(nèi)參基因C36425在慈菇不同組織進(jìn)行熒光定量表達(dá)分析的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，所述不同組織為慈姑的根、莖、葉片、匍匐莖、花和球莖。

進(jìn)一步的，所述熒光定量表達(dá)分析優(yōu)選的引物對(duì)其上游序列如序列表SEQ IDNO.2所示，下游序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

進(jìn)一步的，所述熒光定量表達(dá)分析的PCR反應(yīng)體系為：2X SYBR Green MasterMix10μl、10μM上游引物0.4μl、10μM下游引物0.4μl、ddH₂O 7.2μl、cDNA2μl；反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃，5min；95℃變性10s，55℃退火10s，總共45個(gè)循環(huán)；采集熒光信號(hào)。

本發(fā)明的慈姑內(nèi)參基因C36425，篩選方法為：1、采集慈姑的根、莖、葉片、匍匐莖、花和球莖為材料，提取慈姑不同組織的RNA；2、合成相應(yīng)的慈姑球莖cDNA；3、根據(jù)不同基因設(shè)計(jì)不同引物并在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，繪制溶解曲線，進(jìn)行穩(wěn)定性分析，獲得穩(wěn)定性好、表達(dá)效果好的內(nèi)參基因。

本發(fā)明具有如下有益效果：