[發明專利]貓干擾素γ的可溶性原核表達和純化方法及應用

有效

• 申請號: 202110426900.2
• 申請日: 2021-04-20
• 公開（公告）號: CN113121672B
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發明（設計）人: 魏衍全;張勇;成述儒;武小椿;任麗君
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C07K14/57
• 分類號: C07K14/57;C12N15/70;C12N15/62;C12N15/64;C12N1/21;C07K1/22;C12R1/19
• 代理公司: 深圳國聯專利代理事務所(特殊普通合伙) 44465
• 代理人: 鐘志蕓

1.一種貓干擾素γ(feline interferonγ,FeIFN-γ)的可溶性原核表達和純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)FeIFN-γ蛋白的信號肽序列和理化性質分析

通過SignalP-4.0Server和Expasy在線服務器分別預測、分析FeIFN-γ蛋白的信號肽段和理化性質；

(2)原核表達質粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ的構建

根據GenBank收錄的FeIFN-γ序列GenBank No. NM_00100987 3.1，舍棄掉前20位氨基酸的信號肽設計PCR引物，分別通過引物引入BamH I和Hind Ⅲ酶切位點，進行PCR擴增，然后將PCR產物經雙酶切后回收目的基因片段，同時雙酶切、回收pET28a-SUMO載體片段，該表達載體是將pET28a進行改造使其在N端His標簽后融合一個SUMO標簽，經T4 DNA連接酶連接后，轉入DH-5α感受態細胞，提取質粒經PCR和雙酶切驗證后測序，測序正確后命名為pET28a-SU MO-FeIFN-γ；

(3)含重組質粒的BL21細菌的誘導表達與重組蛋白的可溶性分析

將重組質粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ轉入BL21感受態細胞，挑取單克隆菌落，接種于含有卡那霉素抗性的LB培養液中過夜培養，次日以1:100轉接入新的含卡那霉素抗性的LB培養液中，于37℃、220r/min搖床震蕩培養2h，待菌液OD₆₀₀值達到0.6～0.8，取1mL菌液作為對照，剩余菌液加入IPTG誘導劑，終濃度為1mmol/L，在16℃、220r/min搖床培養10h后以8000rpm離心10min收集菌體，棄去上清后的菌體沉淀加入結合緩沖液，用移液器多次吹打菌體重懸并加入PMSF，終濃度為1mmol/L，重懸后的菌液超聲破碎，全程置于冰上操作，超聲3s，停頓4s，功率220W，以菌液變得清澈透亮為準，超聲結束后將菌液以10000rpm離心10min，收集上清、沉淀制備樣品，用SDS-PAGE電泳檢測分析蛋白的表達水平及水溶性情況；

(4)SUMO-FeIFN-γ融合蛋白最佳表達條件的篩選

在培養瓶中以1：100加入菌液和含卡那霉素抗性的LB培養液，于37℃、220r/min搖床震蕩培養，當菌液OD₆₀₀值到0.6～0.8時，將各培養瓶分別按IPTG濃度梯度、誘導溫度梯度及時間梯度進行條件篩選，用SDS-PAGE電泳檢測SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的表達水平；

(5)SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的大量表達和純化

在確定最佳表達條件后擴大培養，將誘導、超聲后的上清用濾膜過濾進行純化，取Ni親和層析柱用蒸餾水清洗，并用結合緩沖液平衡多次，然后將濾液加入層析柱后置于室溫結合2h，以0.5～1mL/min的流速收集流穿液；將層析柱的液體用洗滌緩沖液以1mL/min的流速清洗Ni柱，以8-10倍柱體積的用量去除雜蛋白；最后用5～10倍柱體積的洗脫緩沖液以0.5～1mL/min的流速洗脫層析柱上的蛋白，收集的樣品均要置于冰上，最后用SDS-PAGE電泳檢測；

(6)SUMO-FeIFN-γ融合蛋白的酶切和純化

將Sumo蛋白酶以1：10比例加入洗脫的融合蛋白液，4℃條件下酶切，分別收集不同時間段的酶切產物，使用30ku截留柱和10ku截留柱對酶切后的蛋白脫鹽、濃縮和進一步的純化，SDS-PAGE電泳檢測，用Bradford測定法測定目的蛋白濃度。

2.根據權利要求1所述貓干擾素γ的可溶性原核表達和純化方法，其特征在于：所述結合緩沖液為含50mM Na₂HPO₄、300mM NaCl、10mM咪唑的pH 8.0的溶液。

3.根據權利要求1所述貓干擾素γ的可溶性原核表達和純化方法，其特征在于：所述SUMO-FeIFN-γ融合蛋白誘導表達的條件為IPTG濃度0.8mmol/L、溫度16℃、時間9h。