[發(fā)明專利]一種單抗N-糖糖型的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110407676.2
• 申請(qǐng)日: 2021-04-15
• 公開（公告）號(hào): CN113109477B
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李杰;蔣露;舒占永;趙雪娜;陶佳林;王永忠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州藥明生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06;G01N30/64
• 代理公司: 北京精金石知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11470
• 代理人: 尉月麗

本發(fā)明公開了一種單抗N?糖糖型的檢測(cè)方法，具體包括對(duì)單抗N?糖的前處理方法和檢測(cè)方法，所述前處理方法為利用置換緩沖液將樣品進(jìn)行換液處理后，再加入內(nèi)切酶進(jìn)行酶切脫糖，所述檢測(cè)方法為利用上述的前處理方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理后，再進(jìn)行寡糖回收、寡糖標(biāo)記、復(fù)溶和液相色譜檢測(cè)。本發(fā)明采用檸檬酸作為置換緩沖液，換液后無需再加入變性劑和中和變性劑，簡(jiǎn)化了脫糖步驟，操作簡(jiǎn)便，節(jié)省時(shí)間，且產(chǎn)生的樣品可直接用還原毛細(xì)管凝膠電泳的方法監(jiān)測(cè)脫糖效率，保證了方法的準(zhǔn)確性；本發(fā)明優(yōu)化了復(fù)溶試劑，樣品峰的響應(yīng)值提高，使各個(gè)峰的靈敏度提高，有利于積分并真實(shí)反映樣品的糖型情況。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體來說，涉及一種用于提高單抗N-糖糖型檢測(cè)的響應(yīng)值且簡(jiǎn)化前處理步驟的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

在眾多的蛋白質(zhì)翻譯后修飾中，糖基化修飾是最重要和最復(fù)雜的修飾之一，也是評(píng)價(jià)抗體的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一。單抗藥物功能的實(shí)現(xiàn)與其糖基化修飾密切相關(guān)，糖基化修飾會(huì)影響蛋白的性能，如構(gòu)象、穩(wěn)定性、溶解度、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、活性及免疫原等。根據(jù)糖基化的修飾位點(diǎn)可將糖基化分為N位糖基化和O位糖基化。N位糖基化位于Asn-297，寡糖中的N-乙酰氨基葡萄糖與天冬酰胺殘基上的酰胺氮連接修飾蛋白，起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完成于高爾基體。

傳統(tǒng)的N-糖糖型的檢測(cè)方法，主要由樣品前處理、酶法或化學(xué)法糖鏈釋放、糖鏈熒光標(biāo)記及高效液相色譜檢測(cè)等部分組成，其中，具體包括以下步驟：

1.緩沖液置換：取200μg樣品到10kD超濾濃縮管中，用50mmol/L PB(磷酸鹽緩沖液)補(bǔ)足至400μL進(jìn)行換液，13000rpm離心10min，重復(fù)該操作兩次，離心結(jié)束后，倒扣含有樣品的10kD超濾管于新的離心管中，10000rpm離心1min，將收集的樣品轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，用50mmol/L PB補(bǔ)足至180μL，渦旋混勻；

2.脫糖：向置換好Buffer樣品中加入20μL 10×變性緩沖液(5％SDS，0.4mol/LDTT)，渦旋溶解后短暫離心，100℃加熱10min，10-30℃放置5min后，加入40μL 10％NP-40混勻。加入1μL PNGase F，渦旋混勻并短暫離心，水浴37℃孵育16-24h；

3.寡糖回收：加入500μL預(yù)冷的無水乙醇，-80℃冰箱放置30min，以13000rpm離心10min。取500μL上清液至1.5mL離心管中，在10-30℃條件下，真空干燥2-4h至離心管底部有少量液體剩余；

4.寡糖標(biāo)記：干燥后的樣品，加入20μL標(biāo)記試劑(2-AB)，渦旋混勻，以10000rpm離心30s。置于65℃干浴中標(biāo)記2.5h，加入80μL 70％乙腈溶解，渦旋至沉淀完全溶解。以10000rpm離心1min，取上清液備用。

該方法存在如下缺點(diǎn)：(1)對(duì)于某些樣品的響應(yīng)值較低，導(dǎo)致一些小的峰不能被有效積分；(2)樣品前處理步驟繁多；(3)難以考察酶切(脫糖)效率：理論上N-糖糖型的分析方法是需要用還原型毛細(xì)管凝膠電泳的方法來檢測(cè)前處理步驟中酶切(脫糖)是否徹底，但傳統(tǒng)的樣品前處理方法中需要加入過量的NP-40來屏蔽變性緩沖液中的SDS從而消除SDS對(duì)酶活的影響，而一旦加入NP-40，則還原型毛細(xì)管凝膠電泳難以再對(duì)樣品是否酶切(脫糖)完全予以檢測(cè)，倘若脫糖不完全，則N-糖檢測(cè)結(jié)果會(huì)失真。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種可以提高單抗N-糖糖型檢測(cè)的響應(yīng)值，且簡(jiǎn)化前處理步驟的檢測(cè)方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種單抗N-糖糖型檢測(cè)的前處理方法，利用置換緩沖液將樣品進(jìn)行換液處理后，再加入內(nèi)切酶進(jìn)行酶切脫糖。

優(yōu)選地，所述置換緩沖液為檸檬酸溶液。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述檸檬酸溶液的濃度為15-25mmol/L,pH為6.3-6.7；最優(yōu)選為20mmol/L,pH為6.5。