[發明專利]外泌體用于防止腦型瘧疾發生的實驗方法有效

申請號：	202110401910.0	申請日：	2021-04-14
公開（公告）號：	CN113144222B	公開（公告）日：	2023-05-23
發明（設計）人：	陳光;杜云婷	申請（專利權）人：	臺州學院
主分類號：	A61K49/00	分類號：	A61K49/00;A61K35/18;A61P33/06;C12N5/078
代理公司：	深圳紫晴專利代理事務所(普通合伙) 44646	代理人：	陳映輝
地址：	318000 浙江***	國省代碼：	浙江;33
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摘要：
搜索關鍵詞：	體用防止瘧疾發生實驗方法
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【說明書】：

本發明的是外泌體用于防止腦型瘧疾發生的實驗方法，包括利用P.y17XNL鼠瘧模型，提取外周血后超速離心法或磁珠免疫捕獲法分離純化外泌體；利用外泌體或外泌體聯合CpGODN免疫正常C57BL/6J小鼠，固定時間點P.bANKA攻擊，動態觀察感染過程、神經系統癥狀和血腦屏障(BBB)完整性，確定外泌體的免疫效應。通過提取異種瘧原蟲感染后宿主外周血中的外泌體，采用尾靜脈注射單獨免疫外泌體或皮下注射外泌體聯合CpGODN兩種方法于0天和20天分別免疫C57BL/6J小鼠兩次，第二次免疫20天后1×10supgt;6/supgt;P.bANKA寄生的紅細胞(pRBC)攻擊免疫小鼠。實驗結果發現，與模型組相比，免疫組小鼠蟲血癥明顯降低，生存率高達90?100％。神經系統癥狀未出現，且小鼠BBB保持完整性；證明外泌體可有效保護C57BL/6J小鼠防止腦瘧的發生。

技術領域

本發明涉及瘧疾預防技術領域，具體涉及一種外泌體用于防止腦型瘧疾發生的實驗方法。

背景技術

瘧疾是一種嚴重危害人類健康的全球感染性疾病。據2020WHO瘧疾報告，2019年全球有89個國家和地區流行瘧疾，約2.29億人感染，因瘧疾而死亡的人數達40.9萬。特別是在非洲等發展中國家，瘧疾仍然是5歲以下兒童死亡的主要原因。僅在撒哈拉以南非洲地區每年至少20萬人死于重癥瘧疾，其中惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum，Pf)引起的腦型瘧疾(簡稱腦瘧，cerebral?malaria,CM)是重癥患者致死的主要原因。CM致死率高達15-25％，死亡人數占瘧疾總死亡人數的90％，而且四分之一幸存病人還會患有長期的神經和認知缺陷。

因此深入了解CM發生、發展過程中相關致病機制及瘧原蟲與宿主相互作用是全球范圍內控制和根除瘧疾、開發有效瘧疾疫苗的基礎和前提。

寄生蟲與寄生部位的組織均能夠分泌外泌體，但蟲源外泌體與宿主源外泌體難以區分。目前組織外泌體的提取尚處于起步階段，因此選擇最佳提取方法是未來工作的重點。蟲源外泌體作用于宿主的機制仍不明確，其調控宿主細胞的生物活性物質還有待研究。

發明內容

本發明提出的一種外泌體用于防止腦型瘧疾發生的實驗方法，可解決上述技術問題。

為實現上述目的，本發明采用了以下技術方案：

一種外泌體用于防止腦型瘧疾發生的實驗方法，包括：

S1、利用P.y17XNL鼠瘧模型，提取外周血后超速離心法或磁珠免疫捕獲法分離純化外泌體；

S2、利用外泌體或外泌體聯合CpGODN免疫正常C57BL/6J小鼠，固定時間點P.bANKA攻擊，動態觀察感染過程、神經系統癥狀和血腦屏障(BBB)完整性，確定外泌體的免疫效應。

進一步的，所述S1具體包括外泌體提取和外泌體鑒定；

其中，外泌體提取包括BALB/c小鼠經腹腔注射1×10⁶P.y17XNL寄生的紅細胞(pRBC)，確定蟲血癥20％-30％后提取外泌體；

采用超速離心法或磁珠免疫捕獲法提取P.y17XNL感染的BALB/c小鼠外周血中的外泌體，測蛋白濃度后置于-80℃冰箱中備用；

所述外泌體鑒定包括采用透射電鏡和WB方法對上述提取的外泌體形態結構、粒徑大小和表面特異性分子的表達進行分析。