[發(fā)明專(zhuān)利]基于生物信息學(xué)富集胎兒游離DNA用于拷貝數(shù)變異的分析方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110397074.3
• 申請(qǐng)日: 2021-04-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113270138B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許雄;胡大輝;丁琳楓;肖銳;李海波;施丹華;田麗蘊(yùn);徐軍;邱海燕
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 杭州博圣醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司;寧波市婦女兒童醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): G16B5/00
• 分類(lèi)號(hào): G16B5/00;G16B20/20;G16B20/30
• 代理公司: 杭州求是專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 鄭海峰

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于生物信息學(xué)富集胎兒游離DNA用于拷貝數(shù)變異的分析方法。本發(fā)明選擇性挑選雙端都比對(duì)到參考基因組的主要來(lái)自于胎兒的短片段reads，本發(fā)明通過(guò)計(jì)算不同片段長(zhǎng)度的均一化后性染色體reads數(shù)占總常染色體reads數(shù)的占比計(jì)算胎兒DNA含量，選取胎兒DNA含量最高的游離DNA片段長(zhǎng)度范圍做后續(xù)非整倍體和CNV分析。本發(fā)明可以提高胎兒DNA濃度比例，對(duì)于分析胎兒染色體非整倍性、染色體片段拷貝數(shù)異常等應(yīng)用的準(zhǔn)確性有極大提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基于NGS測(cè)序的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查應(yīng)用生物信息數(shù)據(jù)分析領(lǐng)域，具體涉及一種基于生物信息學(xué)富集胎兒游離DNA用于拷貝數(shù)變異的分析方法。

背景技術(shù)

1997年，香港中文大學(xué)的Denise?Lo發(fā)現(xiàn)血液中存在來(lái)自于胎兒的游離DNA片段，其平均含量大概占母血中總游離DNA含量的13％。通過(guò)對(duì)懷孕12周以上的孕婦外周血中游離DNA片段分離提取，采用大規(guī)模平行測(cè)序方法，可準(zhǔn)確檢測(cè)胎兒的染色體和片段拷貝數(shù)異常、性別判定、單基因病篩查等。

目前胎兒游離DNA富集主要通過(guò)電泳分離法或磁珠富集的實(shí)驗(yàn)方法。但由于胎兒的游離DNA片段含量極低，很難分離不同長(zhǎng)度的游離DNA片段，且還會(huì)造成樣本損失。兩種富集方法還增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜度和建庫(kù)時(shí)間周期的延長(zhǎng)，這兩種方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)會(huì)使比對(duì)上的reads冗余度升高，同時(shí)reads在參考基因組上的分布均一性變差，可導(dǎo)致假陽(yáng)性率增加。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，考慮隨著下一代測(cè)序成本的降低，在一定范圍內(nèi)增加測(cè)序量，盡可能抽取來(lái)自于胎兒的DNA分子，通過(guò)生物信息篩選的方法，提高胎兒DNA占比，從而對(duì)分析胎兒染色體非整倍體和染色體片段CNV有更高的準(zhǔn)確性，同時(shí)能夠減少因胎兒DNA含量不足帶來(lái)的重上機(jī)或重采血的比例，檢測(cè)的樣本合格率更高，從而進(jìn)一步降低成本。

因?yàn)樘貉獫{游離DNA比母親游離DNA片段偏短，在不改變實(shí)驗(yàn)提取DNA和建庫(kù)方法的前提下，我們?cè)跍y(cè)序數(shù)據(jù)層面通過(guò)雙末端測(cè)序，基于兩條reads比對(duì)到參考基因組上的位置計(jì)算片段長(zhǎng)度分布。基于片段長(zhǎng)度分布，以10bp為step，分別挑選50-200，50-210，50-220，50-230，50-240，50-250；60-200，60-210，60-220，60-230，60-240，60-250；…,120-200,120-210,120-220,120-230,120-240,120-250…游離DNA片段長(zhǎng)度位于這些區(qū)域內(nèi)的reads，對(duì)每個(gè)樣本計(jì)算每條染色體上和每個(gè)滑動(dòng)窗口內(nèi)的reads數(shù)、GC，并對(duì)每個(gè)樣本的reads數(shù)，用總比對(duì)到常染色體的reads數(shù)做均一化處理。

通過(guò)計(jì)算不同片段長(zhǎng)度的均一化后性染色體reads數(shù)占總常染色體reads數(shù)的占比計(jì)算胎兒DNA含量，選取胎兒DNA含量最高的游離DNA片段長(zhǎng)度范圍做后續(xù)非整倍體和CNV分析

對(duì)于常染色體和女性胎兒X染色體，通過(guò)計(jì)算出來(lái)的CNV的拷貝數(shù)減掉正常拷貝數(shù)2，乘以100％即可得到此CNV的嵌合比例(MosRatio)；對(duì)于男性胎兒的X染色體和Y染色體，通過(guò)計(jì)算出來(lái)的CNV的拷貝數(shù)減掉正常拷貝數(shù)1，乘以100％即可得到此CNV的嵌合比例。如果此嵌合比例小于50％，一般反映的是胎兒DNA含量的大小，與胎兒DNA含量成正相關(guān)。如果當(dāng)前樣本有較多的CNV(可能包含良性和致病性CNV)，所有CNV的嵌合比例的中位數(shù)與胎兒DNA含量近似相當(dāng)。

本發(fā)明的具體可選方案：

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于生物信息學(xué)富集胎兒游離DNA的分析方法，其包括如下步驟：

1)將雙端reads不容錯(cuò)比對(duì)到參考基因組，記錄比對(duì)到參考基因組上的染色體、坐標(biāo)位置和reads的GC；

2)保留雙端都比對(duì)到參考基因組，且insert?size在1kb以內(nèi)的reads；所述insertsize指一對(duì)比對(duì)到參考基因組上的reads的雙末端的距離；