[發明專利]制備β-煙酰胺單核苷酸的方法、酶組合物及其應用

在審

• 申請號: 202110394271.X
• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號: CN113106132A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 潘永強;盧錦春;王駿
• 申請（專利權）人: 百瑞全球有限公司
• 主分類號: C12P19/30
• 分類號: C12P19/30
• 代理公司: 北京天昊聯合知識產權代理有限公司 11112
• 代理人: 王靜;高釗

1.一種制備β-煙酰胺單核苷酸的方法，包括以下步驟：

1)提供微生物的提取物，其中所述微生物的提取物中包含氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；

2)將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶與所述微生物的提取物混合，使所述煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶與所述氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸反應，生成β-煙酰胺單核苷酸和AMP；

其中所述煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法還包括在磷酸或其衍生物的存在下將AMP磷酸化酶與所述微生物的提取物混合，并且使所述AMP磷酸化酶與所述步驟2)中所產生的AMP反應，其中所述AMP磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根據權利要求1所述的方法，其中所述微生物提取物中還包含還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，并且所述方法還包括在二氧化碳或其衍生物的存在下將甲酸脫氫酶與所述微生物的提取物混合，并且使所述甲酸脫氫酶與所述還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸反應，其中所述甲酸脫氫酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根據權利要求1所述的方法，其中所述煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶與所述微生物的提取物的重量比為(0.01-100):1，優選為(0.05-50):1，更優選為(0.1-10):1。

5.根據權利要求2所述的方法，其中所述AMP磷酸化酶與所述微生物的提取物的重量比為(0.01-100):1，優選為(0.05-50):1，更優選為(0.1-10):1；并且所述磷酸或其衍生物的量為0.1mM-0.5M。

6.根據權利要求3所述的方法，其中所述甲酸脫氫酶與所述微生物的提取物的重量比為(0.01-100):1，優選為(0.05-50):1，更優選為(0.1-10):1；并且所述二氧化碳的通氣量為0.01-100vvm，優選為0.1-10vvm，更優選為0.5-3vvm。

7.根據權利要求1所述的方法，其中所述微生物選自大腸桿菌、芽孢桿菌、霉菌和酵母菌，優選為酵母菌。

8.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法包括以下步驟：

A)提供酵母菌提取物，其中該酵母菌提取物中包含氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；

B)在二氧化碳或其衍生物的存在下，將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和甲酸脫氫酶與所述酵母菌提取物混合；

其中所述煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和甲酸脫氫酶的氨基酸序列分別如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.3所示。

9.根據權利要求8所述的方法，其中所述步驟B)還包括在磷酸或其衍生物的存在下將AMP磷酸化酶與所述酵母菌提取物混合，其中所述AMP磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

10.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法包括以下步驟：

I)提供酵母菌提取物，其中該酵母菌提取物中包含氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；

II)在二氧化碳或其衍生物的存在下，將甲酸脫氫酶與所述酵母菌提取物混合；

III)當所述酵母菌提取物中的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的量下降至步驟I)時的0.1-99％以下時，將該酵母菌提取物與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶混合；

其中所述煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和甲酸脫氫酶的氨基酸序列分別如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.3所示。

11.根據權利要求10所述的方法，其中所述步驟III)還包括，當所述酵母菌提取物中的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的量下降至步驟I)時的0.1-99％以下時，將該酵母菌提取物在磷酸或其衍生物的存在下與AMP磷酸化酶混合，其中所述AMP磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。