[發明專利]一種熒光素異構體的純化方法

在審

• 申請號: 202110392121.5
• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號: CN115197237A
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發明（設計）人: 陸林海;陸陽;苗茹;王純莎
• 申請（專利權）人: 蘇州諾維康生物科技有限公司
• 主分類號: C07D493/10
• 分類號: C07D493/10;C09B11/08;C09B67/54;C09K11/06
• 代理公司: 蘇州威世朋知識產權代理事務所(普通合伙) 32235
• 代理人: 楊林潔

本發明涉及一種熒光素異構體的純化方法，通過用混合溶劑結晶的方法分離羧基熒光素的5,6異構體，先將羧基熒光素的異構體混合物溶于第一種有機溶劑A中，再加入一定比例的第二種極性有機溶劑B，低溫放置24小時，過濾，收集固體得6?羧基熒光素異構體，一次結晶就可以達到純度95％以上，方法簡單，易于規模化生產。

技術領域

本發明屬于熒光染料合成技術領域，尤其涉及一種熒光素異構體的純化方法。

背景技術

熒光探針就是以熒光物質為指示劑，在一定波長激發下使熒光物質產生熒光，通過檢測所產生的熒光對被檢測物質進行定量或定性分析。在生物醫學檢測方面，熒光探針相對于其他檢測法，具有高靈敏度，高選擇性，響應快，重復性好，操作簡便，成本低等優點，因而在分子診斷，基因檢測，抗體免疫分析等方面得到廣泛的應用。熒光探針由識別基團、熒光基團和連接體三部分組成，識別基團決定探針的選擇性特異性，熒光基團決定探針的靈敏度，連接體部分在探針中起到連接樞紐的作用。熒光染料在熒光探針中都以熒光基團的身份存在，它的光物理性質是探針性能的重要體現。

目前，用于標記或衍生的熒光探針主要有羅丹明類、熒光素類、鄰苯二甲醛類等，其中熒光素類化合物在生物研究領域中占有及其重要的位置。熒光素類染料化學合成方法簡單，一般是通過富電子的間苯二酚與鄰苯二甲酸酐在酸性條件下縮合而成，但是在合成過程中會產生5,6-羧基異構體，如圖1所示，這種異構體的混合物在用于定量時由于兩個異構體的最大吸收和發射波長有不同，會導致譜帶變寬，且混合物中兩個異構體的比例難以控制，會導致定量的不準確，故5-和6-位羧基異構體混合物直接應用的限制性是顯而易見的，有必要將5-和6-位羧基異構體分離出來，因此，熒光素染料異構體的拆分提純是至關重要的。

從分子結構上講，5,6-羧基熒光素(HEX)屬于呫噸染料類，這類染料5,6-羧基熒光素異構體分離的傳統方法如下：在異構混合物中加入乙醇溶解，加入二異丙胺與羧基成鹽，零下20度放置24小時，有結晶固體析出，過濾收集固體得6-位異構體，純度大于80％，然后用同樣方法多次結晶，純度提高到95％以上。根據目前報道(CN101451018A)，我們在HEX的5,6-熒光素異構體分離中，也嘗試過該方法，但效果不佳，需要經過反復多次結晶，6-羧基異構體也只能達到80％的純度，分離提純步驟繁瑣，提純度不高，不易于規模化生產。

發明內容

本申請的目的主要是提供一種熒光素染料異構體的純化方法，且該方法操作簡單，提純度高，易于規模化生產。

為實現上述目的，本申請提供了一種熒光素異構體的純化方法，包括如下步驟：S1、按比例將5,6-羧基熒光素異構體粗品溶解于有機溶劑A中，充分溶解后，得到第一混合溶液；S2、按比例向步驟S1所述的第一混合溶液中加入有機溶劑B，所述有機溶劑B與所述有機溶劑A不同，充分混合，得到第二混合溶液；S3、將步驟S2中的第二混合溶液冷卻到0℃，再向所述第二混合溶液中滴加二異丙基胺，繼續攪拌，低溫靜置，析出固體，過濾掉清液留取固體，得到濾餅，洗滌濾餅，收集固體；S4、將步驟S3收集的固體溶于乙酸乙酯中，加入鹽酸，室溫攪拌，萃取分層，收集有機相，減壓濃縮后得到6-羧基熒光素異構體。

進一步的，所述5,6-羧基熒光素異構體為2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-5,6-羧基特戊酸酯熒光素異構體，所述6-羧基熒光素異構體為2’,4,4’,5’,7’,7-六氯-6-羧基特戊酸酯熒光素異構體。

進一步的，步驟S1中，所述有機溶劑A為乙醇、甲醇、異丙醇、DMF、DMSO、丙酮中的任意一種。

進一步的，步驟S2中，所述有機溶劑B為乙醇、甲醇、異丙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯中的任意一種。

進一步的，所述有機溶劑A與所述有機溶劑B的體積比為1:1～5:1。

進一步的，所述有機溶劑A與所述有機溶劑B的體積比為4:1。