[發明專利]一種牛源致病性蠟樣芽孢桿菌間接ELISA檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202110391995.9
• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號: CN112986560A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 王學理;何云江;郗珊珊;孟慶磊;陳云嬌
• 申請（專利權）人: 內蒙古民族大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;G01N33/68;C12N1/20;C12R1/085
• 代理公司: 北京中政聯科專利代理事務所(普通合伙) 11489
• 代理人: 陳強

本發明涉及微生物檢測技術，即一種牛源致病性蠟樣芽孢桿菌間接ELISA檢測試劑盒。其特點是：所述間接ELISA檢測試劑盒以牛源致病性蠟樣芽孢桿菌菌懸液為包被抗原。有益效果：所制備的檢測試劑盒適用于牛源致病性蠟樣芽孢桿菌的檢測，且具有檢測特異性強，靈敏度高，檢測過程快，操作方便等特點，為預防牛的蠟樣芽孢桿菌感染提供了有效的技術與工具。

技術領域

本發明涉及微生物檢測技術，具體涉及一種牛源致病性蠟樣芽孢桿菌間接ELISA檢測試劑盒。

背景技術

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus.Frankland）屬芽孢桿菌科，蠟樣芽孢桿菌屬，該菌與蘇云金芽孢桿菌及炭疽桿菌等生物學特性相近，廣泛存在于自然環境及食物中。可產生抗菌物質，抑制有害微生物的繁殖，降解土壤中的營養成分，改善生態環境。部分蠟樣芽孢桿菌可作為促植物生長劑及動物飼料內的微生物添加劑。該細菌為條件致病菌，臨床多使人或動物發生嘔吐或腹瀉，為常見的食源性致病菌之一。但在此之前并未查到該細菌對牛感染致死的相關報道。2018年內蒙古通遼市多地出現牛猝死病例，我們對其中的兩頭病死牛進行炭疽桿菌病、口蹄疫病毒病等傳染性疾病的排查后，對其血液進行細菌培養并發現有菌落生長。對生長細菌進行分離鑒定，最后確定其為蠟樣芽孢桿菌。為了對該牛源致病性蠟樣芽孢桿菌引起的疾病進行快速、有效檢測，臨床上必須建立靈敏、特異、高效的蠟樣芽孢桿菌血清學檢測技術。

發明內容

本發明的目的是提供一種牛源致病性蠟樣芽孢桿菌間接 ELISA檢測試劑盒。

上述目的是由以下技術方案實現的：

提供一種牛源致病性蠟樣芽孢桿菌間接ELISA檢測試劑盒，所述間接ELISA檢測試劑盒以牛源致病性蠟樣芽孢桿菌菌懸液為包被抗原。

所述牛源致病性蠟樣芽孢桿菌菌懸液由如下方法制備而成：

將牛源致病性蠟樣芽孢桿菌劃線接種于普通瓊脂培養基上，37℃過夜培養，挑取單個菌落接種到LB液體培養基，37℃培養12-24h后；將培養得到的蠟樣芽孢桿菌培養物離心，收集菌體，洗滌，用碳酸鹽緩沖液重懸菌體，制成蠟樣芽孢桿菌菌懸液。

所述普通瓊脂培養基由以下重量的原料及方法制成：

蛋白胨10g、瓊脂14g、氯化鈉5g、牛肉浸出粉3g、蒸餾水1000ml，加熱煮沸溶解，分裝，121℃高壓滅菌15分鐘備用。

所述LB液體培養基原料及制備方法為:蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化鈉5g、葡萄糖2-3g、蒸餾水1000ml，調PH至7.2-7.4，加熱煮沸溶解，分裝，121℃高壓滅菌15分鐘備用。

所述間接ELISA檢測試劑盒還包括：酶標板、封閉液、牛源致病性蠟樣芽孢桿菌陽性血清、牛源致病性蠟樣芽孢桿菌陰性血清、酶標二抗、底物顯色液和終止液。

所述封閉液為5％脫脂奶粉。

所述酶標二抗為HRP-羊抗牛IgG。

上述間接ELISA檢測試劑盒檢測蠟樣芽孢桿菌抗體的方法，包括以下步驟：

1.用抗原包被液將蠟樣芽孢桿菌菌懸液1：60稀釋，包被酶標板，4℃包被過夜；

2.取出酶標板，用PBST溶液洗滌，加入封閉液，37℃封閉2h；

3.分別加入1：200稀釋后的牛源致病性蠟樣芽孢桿菌陽性血清、牛源致病性蠟樣芽孢桿菌陰性血清和待檢血清；37℃孵育1h；

4.加入按1:8000稀釋的酶標二抗，37℃孵育1h；

5.加入底物顯色液，37℃避光反應15min；

6.加入終止液進行終止反應，在450nm處讀取吸光值，對檢測結果進行判定，若待測樣品的OD_450nm 0.525，判定為陽性，反之則為陰性。