[發明專利]一種高效合成核黃素的基因工程菌及其應用

有效

• 申請號: 202110388765.7
• 申請日: 2021-04-12
• 公開（公告）號: CN113073074B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 饒志明;尤甲甲;楊套偉;吳美琪;張顯;徐美娟
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/75;C12P25/00;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 彭素琴

本發明公開了一種高效合成核黃素的基因工程菌及其應用，屬于生物發酵技術領域，本發明通過敲除了編碼purR的基因，敲低了編碼glnR和tnrA的基因，并且采用過表達了來源于玻璃顫菌的血紅蛋白，解除發酵過程中的溶氧限制，降低發酵過程中的能源消耗，提高核黃素產量；采用本發明構建的工程菌株RF1?aPaGaTgV的核黃素產量在搖瓶階段提高了50.78％，達到2.51g/L。在5?L發酵水平，采用本發明構建的RF1?aPaGaTgV的核黃素的最高產量提高了45.51％，達到10.71g/L。

技術領域

本發明涉及一種高效合成核黃素的基因工程菌及其應用，屬于生物發酵技術領域。

背景技術

核黃素(維生素B2)是維持人體正常生理代謝的營養元素，只能通過飲食獲得。自然界中只有微生物和植物細胞具有合成核黃素的能力，而哺乳動物細胞缺乏相應的合成途徑。核黃素在我們的日常生活中有著廣泛的應用，可以作為食品添加劑、藥品、保健品和化妝品原料等。近年來，微生物發酵生產核黃素在工業上已完全取代化學合成。發酵產生核黃素的微生物主要有Bacillus subtilis和Ashbya gossypii。此外，Candida flareri、E.coli和Lactobacillus plantarum也被用作合成核黃素底盤細胞，但這些菌株在工業生產中很少見到。

微生物細胞具有相似的核黃素合成途徑，有兩個重要的核黃素合成前體：核酮糖-5磷酸來自戊糖磷酸途徑，鳥嘌呤(GTP)來自嘌呤途徑。然后由rib基因編碼的酶通過7步反應將兩種前體轉化為核黃素。枯草芽孢桿菌作為革蘭氏陽性菌，是目前最具競爭力的核黃素生產菌株，已廣泛用于工業核黃素生產。使用枯草芽孢桿菌生產核黃素的一個明顯優勢是，它被美國食品和藥物管理局認定為GRAS(公認安全)菌株，并長期用于嘌呤核苷、肌苷和生產。枯草芽孢桿菌不能天然過度生產核黃素，是經過多輪育種和選擇后獲得這一優良性狀。隨后，通過啟動子替換、基因敲除和外源表達等基因工程和代謝工程策略進一步提高工程菌株的產量。例如，基因purF、purM、purN、purH和purD過表達受強啟動子P₄₃控制，導致工程菌株核黃素產量增加25％。此外，過表達突變體PurF顯著增加核黃素前體鳥嘌呤的合成，并使核黃素的產量增加3倍。雖然目前的代謝工程方法已經大大提高了核黃素的產量，但要繼續提高產量仍存在各種瓶頸。

而目前工業上采用生物法制備核黃素時，主要是采用基因工程菌進行發酵培養生產核黃素，并且，需要采用不斷供氧的方式進行發酵，原因如下：大多數需氧生物代謝過程都以氧為電子受體。溶解氧是好氧微生物發酵過程中的一個重要參數，通常影響細胞的生長和代謝產物的合成。在發酵后期，溶解氧是限制好氧微生物生長和合成的主要因素，特別是高密度發酵。當外界氧氣有限時，微生物可以利用另一種電子受體，即硝酸鹽或亞硝酸鹽，通過厭氧呼吸生長。缺氧導致低效的NADH和NADPH氧化，這是三羧酸(TCA)循環中產生ATP和低代謝流量的必要反應。能量轉換效率低下會直接影響細胞增殖，導致細胞生長緩慢。為了克服這個問題，高密度發酵系統使用純氧來補充或替代供氣，為生長中的細菌提供足夠的氧氣。純供氧將使液體培養中的氧傳輸率不再是一個限制因素。但這也對工業發酵提出了更高的要求，增加了消費成本。

例如公開號為CN102816823B的中國發明專利中公開了一種利用多階段轉速調控策略提高Bacillus subtilis發酵生產核黃素產量的方法；采用多階段控制溶氧的策略提高核黃素的產量，但該方法在工業應用中操作繁瑣，不易掌握調整轉速的時間節點，對工業發酵的操作提出更高的要求，且無法進一步突破溶氧的限制。

盡管生物技術應用有許多優點，但對氧氣的巨大需求已成為大規模生產的瓶頸。核黃素的合成過程需要大量的溶解氧，而溶解氧的水平是限制核黃素生產的重要因素。研究表明，溶解氧不足是核黃素合成的限制因素之一，溶解氧不足導致核黃素合成相關基因表達水平顯著差異。因此，緩解溶氧對核黃素代謝的限制是提高核黃素產量的有效策略；而如何能夠得到一株能夠高效生產核黃素并且不需要采用高成本的供氧體系的基因工程菌成為研究的難點。

發明內容

技術問題：