[發明專利]基于微孔陣列芯片的微量樣本代謝組、蛋白質組和磷酸化蛋白質組多組學分析方法

有效

• 申請號: 202110388038.0
• 申請日: 2021-04-12
• 公開（公告）號: CN113138249B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 秦偉捷;李航;李圓圓
• 申請（專利權）人: 北京蛋白質組研究中心
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/86;G01N30/06;B01L3/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 劉鑫鑫

本發明公開了基于微孔陣列芯片的微量樣本代謝組、蛋白質組和磷酸化蛋白質組多組學分析方法。本發明包括如下步驟：(1)提供微孔陣列芯片，親水修飾；(2)將待測細胞樣本置于微孔中，加入有機溶劑萃取代謝物；分析萃取液，鑒定代謝物；(3)構建僅包含蛋白質組譜和同時包含蛋白質組和磷酸化蛋白質組譜的質譜譜圖數據庫；(4)在萃取代謝物后的微孔中加入蛋白酶，收集消化液；對消化液進行液相色譜?質譜分析；搜索僅包含蛋白質組譜數據庫，鑒定肽段及相應蛋白質；搜索同時包含蛋白質組和磷酸化蛋白質組譜數據庫，鑒定磷酸肽及相應磷酸化蛋白質。本發明利用HILIC分離原理實現代謝物和蛋白質的串聯提取，建立了無需富集的磷酸化蛋白質組分析方法。

技術領域

本發明屬于生物分析技術領域，尤其涉及一種基于微孔陣列芯片的微量樣本代謝組、蛋白質組和磷酸化蛋白質組多組學分析方法。

背景技術

作為構成生物體系的基本單位，細胞在多細胞生物組織中具有不同的分子和功能特性，以及差異化的表型特征。細胞異質性是生物系統的基本特質，基因的差異化表達決定了細胞亞群間差異，而同一細胞亞型對微環境刺激的不同響應也影響著個體細胞的不同表達。解析細胞異質性對于表征細胞亞群特征與功能，以及探索微環境對復雜細胞體系的影響都至關重要。經典組學技術通過分析大量細胞(10⁶)的生物學特征來從整體水平揭示生命的功能特性，而這種混合細胞的平均化檢測可能導致重要信息的稀釋或丟失。相反，單細胞技術可通過細胞逐一檢測來表征細胞間的個體差異，并且也適用于數量稀少的樣本分析，這在神經科學、發育生物學、腫瘤學和干細胞生物學等研究中具有重要價值。

目前，RNA擴增和測序技術的進步使轉錄組技術已成功應用于單細胞水平研究，但是核酸層面的單一組學研究無法全面的解析驅動細胞生長、凋亡、感知和響應環境的動態分子過程以及生物體的發病機理、脅迫機制等。采用多組學整合技術，開展多維度分析逐漸成為系統生物學的發展趨勢。作為細胞生理功能的主要執行者，基因編碼的蛋白質具有復雜的翻譯后修飾(如PTM)、轉運定位、降解、分子間相互作用等過程，在催化代謝反應、調節信號轉導等方面發揮著關鍵作用。代謝分子作為以上生命活動的最終產物，更準確直接地反映生理病理變化或環境改變給機體帶來的影響，是重要的疾病標志物。這些都難以在基因組和轉錄組層面予以有效闡述。更重要的是，作為調控細胞通路的三個關鍵因素，蛋白質、修飾與代謝物相互影響，形成了復雜的調控網絡：轉錄因子可通過調控代謝酶的表達影響代謝物的合成；代謝物也可通過酶促或非酶促等不同途徑修飾多種蛋白質并直接改變其功能活性。因此，迫切需要直接和集成的多組學分析技術，以全面了解蛋白質組學，代謝組學和修飾水平的細胞異質性，以系統解析生物分子功能和調控機制、打通表型與機制。但是，除核酸以外的生物分子，由于缺乏的有效擴增方法，單細胞水平的超微量多組學分析仍然是一個嚴峻的挑戰。

生物質譜技術，作為一種高靈敏度、高精確度、高分辨率的定性定量方法已廣泛應用于生命科學領域，尤其是在組學研究方面發揮了不可替代的作用。在蛋白質、翻譯后修飾以及代謝分子表達與功能研究，以及細胞活動生理機制闡述等方面發揮著重要作用。由于無法使用分子擴增方法，因此減少樣本損失是質譜單細胞組學的關鍵。目前，基于液滴和基于毛細管柱的蛋白質組樣品處理平臺(例如nanoPOTS8，OAD11，iPAD12和ISPEC13等)已被證明在微量/單個細胞的分析中可有效提高檢測靈敏度和蛋白質組學覆蓋率。此外，通過引入“載體細胞”和同量異位標記，SCoPE-MS方法既減少了樣品損失，又增強了質譜信號。對于單細胞代謝組學，通過聯合毛細管顯微操作與ESI-MS或MALDI-TOF-MS，可鑒定數百種代謝分子。

近年來，雖然質譜儀和樣品處理技術的快速發展大力推動了單細胞組學分析，但是蛋白質組、翻譯后修飾蛋白質組以及代謝組的分析仍落后于轉錄組。針對微量或單個細胞的多組學分析，一方面存在著樣本量微小的挑戰，另一個方面不同種類生物分子通常需要獨特的樣品預處理方法而這些方法很難兼容。目前，尚未出現有效的方法能夠同時分析來自同一樣本的蛋白質組、代謝組和翻譯后修飾蛋白質組。

發明內容