[發明專利]一種Pax2條件性基因敲除小鼠模型的構建方法

有效

• 申請號: 202110381604.5
• 申請日: 2021-04-09
• 公開（公告）號: CN112980846B
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 蔚洪恩;呂娜;王穎;王一卓;陳悅悅;王敏;董麗娜
• 申請（專利權）人: 山西省人民醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/89;A01K67/027
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 蘇士瑩

1.一種Pax2條件性基因敲除小鼠模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)以小鼠基因組DNA為模板，分別克隆小鼠Pax2基因的LR、A和RR片段，依次將所述LR、A和RR片段連接至LScKO-2G載體，得特異性打靶載體；克隆所述LR片段的引物包括Pax2-LR-F和Pax2-LR-R，其中所述Pax2-LR-F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.17所示，所述Pax2-LR-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.18所示；克隆所述A片段的引物包括Pax2-A-F和Pax2-A-R，所述Pax2-A-F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.19所示，所述Pax2-A-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.20所示；克隆所述RR片段的引物包括Pax2-RR-F和Pax2-RR-R，所述Pax2-RR-F的核苷酸序列如SEQ?IDNO.21所述，所述Pax2-RR-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.22所示；

(2)將靶向小鼠Pax2基因的sgRNA合成oligos，連接入pUC載體，得Cas9/sgRNA質粒；所述sgRNA的5’Guide序列如SEQ?IDNO.5所示，且所述sgRNA的3’Guide序列如SEQ?ID?NO.10所示；

(3)將Cas9/sgRNA質粒和所述特異性打靶載體顯微注射到小鼠受精卵中，出生后得F₀代小鼠；

(4)篩選F₀代小鼠中基因重組正確的個體與野生型小鼠交配得到F₁代小鼠；

(5)篩選所述F₁代小鼠中基因正確表達的雜合子小鼠與組織特異性的Cre小鼠交配，得所述Pax2條件性基因敲除小鼠模型；

步驟(1)和(2)之間不存在時間上的先后關系。

2.根據權利要求1所述構建方法，其特征在于，步驟(1)中擴增所述LR、A和RR片段的PCR程序，均為：94℃預變性2min；98℃變性10s，67℃退火30s，68℃延伸1kb/min，每個循環退火溫度降低0.7℃，共15個循環；98℃變性10s，57℃退火30s，68℃延伸1kb/min，25個循環；68℃延伸10min。

3.權利要求1所述構建方法，其特征在于，步驟(1)所述連接包括依次將LR片段連接至NotI和BamHI酶切位點之間，將A片段連接至SalI和BglII酶切位點之間，將RR片段連接至XhoI和EcoRI酶切位點之間。

4.權利要求1所述構建方法，其特征在于，步驟(4)所述篩選包括利用兩對引物進行PCR，其中一對包括Pax2-L-GT-F和cKO-5'-DO-F；另一對包括cKO-3'-DO-R和Pax2-R-GT-R；

所述Pax2-L-GT-F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.23所示，所述cKO-5'-DO-F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.24所示；

所述cKO-3'-DO-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.25所示，所述Pax2-R-GT-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.26所示。

5.根據權利要求1所述構建方法，其特征在于，步驟(5)所述篩選包括利用兩對引物進行PCR，其中一對引物包括Pax2-L-GT-F2和cKO-5'-DO-F；另一對引物包括cKO-3'-DO-R和Pax2-R-GT-R1；所述Pax2-L-GT-F2的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.27所示，所述Pax2-R-GT-R1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.28所示。

6.根據權利要求4或5所述構建方法，其特征在于，步驟(4)和步驟(5)所述篩選時，PCR擴增的程序均包括：94℃預變性2min；98℃變性10s，67℃退火30s，68℃延伸1kb/min，每個循環退火溫度降低0.7℃，共15個循環；98℃變性10s，57℃退火30s，68℃延伸1kb/min，25個循環；68℃延伸10min。

7.利用權利要求1或6任一項所述構建方法構建得到的Pax2條件性基因敲除小鼠模型在構建全身性基因敲除小鼠模型中的應用。