[發明專利]GhCIPK6D1基因在提高棉花抗旱性中的應用

有效

• 申請號: 202110381553.6
• 申請日: 2021-04-09
• 公開（公告）號: CN112980874B
• 公開（公告）日: 2022-08-23
• 發明（設計）人: 楊細燕;張獻龍;孫偉男;夏林杰;孫思敏;朱龍付
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;C12N15/113;C12Q1/6895;A01H5/00;A01H6/60
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 戴嵩瑋

1.一種用于敲除GhCIPK6D1基因的方法在提高棉花抗旱性中的應用，其特征在于，所述GhCIPK6D1基因包括以下序列中的至少一種：

1）核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA序列；

2）編碼氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示蛋白質的DNA序列。

2.一種用于敲除GhCIPK6D1基因的sgRNA組合物，其特征在于，包括gRNA1和gRNA2；

所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.一種用于敲除GhCIPK6D1基因的CRISPR/Cas9載體，其特征在于，所述CRISPR/Cas9載體包括權利要求2所述sgRNA組合物。

4.根據權利要求3所述CRISPR/Cas9載體，其特征在于，所述CRISPR/Cas9載體的骨架載體為pRGEB32-7。

5.權利要求3或4所述CRISPR/Cas9載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）以pGTR質粒為模板，采用GhCIPK6D1-a/pGREB32-7s引物對進行第一PCR擴增，得到含gRNA1的片段；所述GhCIPK6D1-a的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述pGREB32-7s的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示;

2）以pGTR質粒為模板，采用GhCIPK6D1-2a/GhCIPK6D1-2s引物對進行第二PCR擴增，得到含gRNA2的片段；所述GhCIPK6D1-2a的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述GhCIPK6D1-2s的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

3）用所述含gRNA1的片段和含gRNA2的片段為模板，用In fpRGEB32-7s/Inf GhCIPK6D1-a引物對進行重疊延伸PCR擴增，得到含gRNA1和gRNA2的DNA片段；所述Inf pRGEB32-7s的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述Inf GhCIPK6D1-a的核苷酸序列如SEQID NO:10所示。