[發明專利]一種一鍋法高效合成萊鮑迪苷M的方法有效
| 申請號： | 202110376139.6 | 申請日： | 2021-04-08 |
| 公開（公告）號： | CN113186141B | 公開（公告）日： | 2023-01-06 |
| 發明（設計）人： | 劉思穎;潘力;王斌 | 申請（專利權）人： | 華南理工大學 |
| 主分類號： | C12N1/21 | 分類號： | C12N1/21;C12N15/70;C12N15/67;C12N15/54;C12N9/10;C12P33/20;C12R1/19 |
| 代理公司： | 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245 | 代理人： | 崔紅麗 |
| 地址： | 510640 廣*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 一鍋 高效 合成 萊鮑迪苷 方法 | ||
1.一種一鍋法高效合成萊鮑迪苷M的方法，其特征在于：包括如下步驟：
分別構建異源表達的UGT76G1，SUS1的重組菌，以及構建高效表達EUGT11的重組菌，所述高效表達EUGT11的重組菌以pET-22b（+）質粒為出發載體，以大腸桿菌作為宿主菌，在多重啟動子操控下高效表達EUGT11，分別經誘導發酵產酶后以細胞粗酶液進行催化反應，利用蔗糖、ST和UDP，將
所述一鍋法多酶級聯反應體系中蛋白質量比例為SUS1：UGT76G1：多重啟動子操控下表達的EUGT11=1：（2～4）：（12.3～36.9）；
所述UGT76G1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述SUS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述EUGT11的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述的多重啟動子為三重啟動子；
所述的啟動子為T7啟動子。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：
所述UGT76G1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述SUS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：
一鍋法多酶級聯反應體系中SUS1的酶活力用量為50 mU/mL，換算成蛋白質量用量為0.8mg/mL。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：
一鍋法多酶級聯反應體系中酶活力比例為SUS1：UGT76G1：多重啟動子操控下表達的EUGT11=1：（1～2）：（2.13～6.39）；
一鍋法多酶級聯反應體系中SUS1的酶活力用量為50 mU/mL。
5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：
一鍋法多酶級聯反應體系中酶活力比例為SUS1：UGT76G1：多重啟動子操控下表達的EUGT11=1：（1～2）：（1.81～5.43）；
一鍋法多酶級聯反應體系中SUS1的酶活力用量為50 mU/mL。
6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述的一鍋法多酶級聯反應體系中，蔗糖的起始反應濃度為100～700 mM； ST的起始反應濃度為1～10mM；UDP的起始反應濃度為2～20mM；
所述的催化反應的條件為35～40℃，180～220r/min催化反應24～48h。
7.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：
誘導發酵中誘導劑為IPTG，IPTG在發酵體系中的濃度為0.5～1 mM；
所述的細胞粗酶液為發酵得到的菌體經超聲破碎所獲得的含酶的粗酶液；
所述的一鍋法多酶級聯反應體系為：蔗糖和UDP經SUS1催化生成UDPG；UDPG和ST經UGT76G1催化生成RA；UDPG和RA經EUGT11催化生成RD；UDPG和RD經UGT76G1催化生成萊鮑迪苷M。
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