[發明專利]一種橡膠草葉綠體提取方法

在審

• 申請號: 202110367518.9
• 申請日: 2021-04-06
• 公開（公告）號: CN113061567A
• 公開（公告）日: 2021-07-02
• 發明（設計）人: 謝全亮;王旭初;李鴻彬
• 申請（專利權）人: 石河子大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 成都中弘信知識產權代理有限公司 51309
• 代理人: 張芳

本發明公開了一種橡膠草葉片葉綠體提取的方法，包括采集橡膠草植物的完整葉片；將所述葉片組織破碎后進行初提得到橡膠草葉綠體粗提液；在細胞分離液的上層加入所述橡膠草葉綠體粗提液后在4℃，進行第一次超高速離心10?15min；離心結束后在吸取所述細胞分離液的的沉淀，用葉綠體提取液清洗沉淀后進行第二次超高速離心12min，沉淀即可得完整橡膠草葉綠體。本發明可以應用于橡膠草葉綠體分離，還可以提取菊科或同屬科植物的葉綠體，既適于從一般的植物材料收取，還可用于頑拗植物葉片的葉綠體分離。

技術領域

本發明屬于植物組織鑒定技術領域，尤其涉及一種橡膠草葉綠體提取方法。

背景技術

橡膠草其中甲羥戊酸(MVA)途徑中用于調節天然橡膠生物合成，橡膠草是二倍體(2n＝16)，具有相對簡單的基因組，長度為1.29Gb，其中包含46,731個預測的蛋白質編碼基因，橡膠草根含有高分子量橡膠分子，其特性與巴西橡膠樹的橡膠膠乳相當，可以作為一種替代橡膠作物，橡膠草根的橡膠含量高，占其總干重的3％至28％，它們也是菊粉的新來源(線性β-(2-1)-連鎖果聚糖)。此外，橡膠草可以在相對較短的生命周期中在寒冷和溫帶地區廣泛生長，并且易于收獲和進行遺傳轉化，因此可以用作發明小麥基因功能的理想模型植物以及天然橡膠的生物合成材料。

葉綠體是行使光合作用的細胞器,皮層葉綠體的結構的基礎。完整葉綠體的獲得是開展葉綠體能量轉化、電子傳遞﹑碳固定及下游組學研究的前提,但關于橡膠草葉綠體的提取尚為空白,嚴重制約了皮層光合作用的生理和分子機制的研究,因此,以橡膠草為材料,建立橡膠草葉綠體的提取純化體系,將在細胞器、亞細胞器和分子水平上推動橡膠草光合作用機制的研究。因此需要一種橡膠草葉綠體提取方法。

發明內容

本發明提供一種應用于橡膠草葉綠體的提取純化的橡膠草葉綠體提取方法。

本發明包括以下步驟：

A采集橡膠草植物的完整葉片；

B將所述葉片組織破碎后進行初提得到橡膠草葉綠體粗提液；

C在細胞分離液的上層加入所述橡膠草葉綠體粗提液后在4℃，進行第一次超高速離心10-15min；

D離心結束后在吸取所述細胞分離液的的沉淀，用葉綠體提取液清洗沉淀后進行第二次超高速離心12min，沉淀即可得完整橡膠草葉綠體。

所述初提的方法包括在所述葉片組織中按照重量比為100：1加入PVPP粉末充分研磨，在所述葉片組織的研磨樣品中按照每克樣品加入5mL葉綠體提取液，過濾研磨液加入葉綠體提取液。

進一步地，提取液的配置方法包括將0.3mM/L山梨醇，5mM/L乙二胺四乙酸EDTA，1mM/LMgCL₂，10mM/LNaHCO₃，0.5mM/L二硫蘇糖醇DTT按照體積比1：1:1:1:2混合后，用ddH₂O定容到850mL完全溶解；接著加入100mL緩沖液溶液，調節酸堿度pH為7.5，全混勻后用ddH₂O定容至1L，得到葉綠體提取液。

進一步地，所述細胞分離液按照由下至上依次鋪70％濃度的細胞分離液1mL、50％濃度的細胞分離液2mL、30％濃度的細胞分離液3mL、10％濃度的細胞分離液4mL，最上面層加入1mL所述葉綠體粗提液。

進一步地，所述超速離心為轉速為8000RCF。

本發明的有益效果為：

本發明可以應用于橡膠草葉綠體分離，還可以提取菊科或同屬科植物的葉綠體，既適于從一般的植物材料收取，還可用于頑拗植物葉片的葉綠體分離。

附圖說明

圖1本發明的流程示意圖；

圖2是本實施例中橡膠草葉綠體提取3次生物學重復驗證對比圖；