[發(fā)明專利]一種羅氏沼蝦外源基因的表達(dá)質(zhì)粒及其轉(zhuǎn)錄表達(dá)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110346557.0
• 申請日: 2021-03-31
• 公開（公告）號: CN113234755B
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任晉東;牛寶龍;樓寶;俞奇力
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C07K14/435
• 代理公司: 北京匯捷知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11531
• 代理人: 趙艷

本發(fā)明公開了一種羅氏沼蝦外源基因的表達(dá)質(zhì)粒及其高效轉(zhuǎn)錄表達(dá)方法，本發(fā)明表達(dá)質(zhì)粒包括順序排列的hr5增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄啟動子IE1、外源目標(biāo)基因和終止子；hr5增強(qiáng)子核苷酸序列如SEQIDNo：1所示，轉(zhuǎn)錄啟動子IE1核苷酸序列如SEQIDNo：2所示。本發(fā)明以10ug質(zhì)粒每g蝦體重的量，從沼蝦腹部頭胸甲和軀干交界線插入微量注射器并注射上述表達(dá)質(zhì)粒，每只蝦注射量控制在5μL～20μL的范圍內(nèi)；注射外源表達(dá)質(zhì)粒4～12h后，采集羅氏沼蝦軀干肌肉組織，并驗(yàn)證外源目標(biāo)基因的表達(dá)量。本發(fā)明對鑒定羅氏沼蝦外源基因肌肉內(nèi)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平更高，高出目前常用啟動子IE1轉(zhuǎn)錄水平約3倍；并且對于外源基因活體表達(dá)的方法快捷高效。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種羅氏沼蝦外源基因的表達(dá)質(zhì)粒及其高效轉(zhuǎn)錄表達(dá)方法。

背景技術(shù)

羅氏沼蝦(Macrobrachium?rosenbergii)是世界上最大型的淡水蝦之一。原產(chǎn)于印度洋-太平洋熱帶地區(qū)，自1976年引入后，產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，市場需求不斷上升。羅氏沼蝦的性別決定屬于ZW型，雌雄個(gè)體表型差異較大，雄性個(gè)體具有體型較大，且在生長速度、抗病性等方面都有著顯著的優(yōu)勢，因此利用生物技術(shù)探索羅氏沼蝦性別決定機(jī)理，對培育羅氏沼蝦單性群體具有重要的意義。

由于羅氏沼蝦細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)體系的缺乏，現(xiàn)有常用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化、病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)行基因功能研究的效率較低在甲殼類動物上，探索有效的外源基因表達(dá)體系是羅氏沼蝦發(fā)育、繁殖等分子遺傳機(jī)理研究的基礎(chǔ)。目前，羅氏沼蝦活體外源基因表達(dá)系統(tǒng)存在的問題有：(1)慢病毒表達(dá)體系能夠攜帶外源基因進(jìn)入對蝦體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，但未發(fā)現(xiàn)表達(dá)效果顯著提升的結(jié)果；(2)在蝦類疾病(白斑病毒)研究過程中，發(fā)現(xiàn)其囊膜蛋白VP28啟動子IE1在蝦類體內(nèi)具有較強(qiáng)的促轉(zhuǎn)錄表達(dá)作用，但是攜帶外援表達(dá)效率相對于病毒體系轉(zhuǎn)錄效率仍然低下不能滿足外源基因功能研究的需要，而關(guān)于羅氏沼蝦的外源基因高效表達(dá)啟動子效果的研究尚未有報(bào)道。

隨著羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等研究的需要，對于關(guān)鍵候選分子基因的功能驗(yàn)證，進(jìn)一步探明候選關(guān)鍵功能基因作用研究，需要借助分子工具進(jìn)行外源基因過表達(dá)和干擾試驗(yàn)，來進(jìn)一步解釋羅氏沼蝦這一重要經(jīng)濟(jì)物種發(fā)育、繁殖生物學(xué)方面關(guān)鍵功能基因的作用，因此需要一種快捷高效的外源基因活體表達(dá)方法，來探索促進(jìn)羅氏沼蝦分子生物作用的揭示與豐富，也為羅氏沼蝦開展基因功能驗(yàn)證研究提供必要分子工具。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種羅氏沼蝦外源基因的表達(dá)質(zhì)粒及其高效轉(zhuǎn)錄表達(dá)方法，旨在解決上述背景技術(shù)中現(xiàn)有技術(shù)的不足之處。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種羅氏沼蝦外源基因的表達(dá)質(zhì)粒，該表達(dá)質(zhì)粒包括順序排列的hr5增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄啟動子IE1、外源目標(biāo)基因和終止子；其中，所述hr5增強(qiáng)子為苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其核苷酸序列如SEQ?ID?No：1所示；所述轉(zhuǎn)錄啟動子IE1為白斑病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其核苷酸序列如SEQ?ID?No：2所示。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種羅氏沼蝦外源基因的活體肌肉內(nèi)的高效轉(zhuǎn)錄表達(dá)方法，該方法包括以下步驟：

(1)以10ug質(zhì)粒每g蝦體重的量，從沼蝦腹部頭胸甲和軀干交界線插入微量注射器并注射表達(dá)質(zhì)粒，每只蝦注射量控制在5μL～20μL的范圍內(nèi)；該表達(dá)質(zhì)粒包括順序排列的hr5增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄啟動子IE1、外源目標(biāo)基因和終止子；其中，所述hr5增強(qiáng)子為苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其核苷酸序列如SEQ?ID?No：1所示；所述轉(zhuǎn)錄啟動子IE1為白斑病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其核苷酸序列如SEQ?ID?No：2所示；

(2)注射外源表達(dá)質(zhì)粒4～12h后，采集羅氏沼蝦軀干肌肉組織，并驗(yàn)證外源目標(biāo)基因的表達(dá)量。