[發明專利]一種酶促合成D-亮氨酸的方法

在審

• 申請號: 202110333271.9
• 申請日: 2021-03-29
• 公開（公告）號: CN112831532A
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 范文超;高書良;丁鵬
• 申請（專利權）人: 洛陽華榮生物技術有限公司
• 主分類號: C12P13/06
• 分類號: C12P13/06;C12N9/04;C12N9/06;C12N15/53
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 賈師英

本發明公開了一種酶促合成D?亮氨酸的方法，其以α?酮異己酸為底物，用D?氨基酸脫氫酶催化底物發生脫氫反應和氨基轉移反應，得到D?亮氨酸，產物ee值超過99％，工業化應用前景廣闊。

技術領域

本發明屬于酶催化技術領域，具體地說，涉及一種酶促合成D-亮氨酸的方法以及用于該方法的D-氨基酸脫氫酶突變體。

背景技術

D-亮氨酸是一種非天然氨基酸，又名D-2-氨基-4-甲基戊酸，CAS號為328-38-1，是一種白色鱗片狀粉末。其為一種支鏈氨基酸，可作為營養補充劑使用，有助于訓練后肌肉的恢復，控制血糖，并給身體組織提供能量，增強免疫力。D-亮氨酸在醫藥、化工領域也有較多應用。

D-亮氨酸可通過發酵法(CN110330441A)獲得；或者通過手性拆分DL-亮氨酸外消旋體方法(CN103981248A)獲得，兩類方法各有利弊，它們共同的特點是成本較高。發酵法生產周期長且發酵后的產物提取和純化步驟繁瑣，手性拆分不論是化學拆分法、酶法或誘導結晶法都必須用價格較高的亮氨酸為原料，在經濟上不可行。

發明內容

為了降低D-亮氨酸的生產成本，本發明開發了一種通過合成法制備D-亮氨酸的新途徑，該酶催化反應的路線如下所示。

發明人對于能夠催化α-酮異己酸生成D-亮氨酸的氨基酸脫氫酶進行了廣泛篩選，篩選出一種立體選擇性高、且酶活力相對較高的氨基酸脫氫酶，其為熱球狀尿素芽孢桿菌(Ureibacillus thermosphaericus)來源的NADP+輔因子依賴的D型氨基酸脫氫酶(簡稱utDAADH)(SEQ ID NO:1)。進一步地，為了提高其酶活力，還通過基因工程對該野生酶進行改造，構建能高效催化α-酮異己酸反應的突變體，從而用于合成高光學純度的D-亮氨酸。具體地，本發明包括如下技術內容。

一種酶促合成D-亮氨酸的方法，其以α-酮異己酸為底物，用D-氨基酸脫氫酶催化底物發生脫氫反應和氨基轉移反應，得到D-亮氨酸。

上述方法中，可以在反應體系中添加葡萄糖脫氫酶和輔酶NADPH。由于D-氨基酸脫氫酶是NADP+輔因子依賴的酶，反應體系中包含葡萄糖脫氫酶依賴的NADP+輔因子再生系統，例如添加有葡萄糖脫氫酶和輔酶NADPH(即NADP+)。借助于NADP+輔因子再生系統，可進一步降低D-亮氨酸的生產成本，在經濟上是有利的。

優選地，反應體系中還可以添加有銨鹽或者氨水作為氨供體。

在一種實施方式中，上述方法中使用的D-氨基酸脫氫酶是熱球狀尿素芽孢桿菌(Ureibacillus thermosphaericus)來源的D-氨基酸脫氫酶SEQ ID NO:1或者與其具有90％以上同源性、優選地95％以上同源性、優選地98％以上同源性、更優選地99％以上同源性的突變體。

MSKIRIGIVGYGNLGRGVEAAIQQNPDMELVAVFTRRDPKTVAVKSNVKVLHVDDAQSYKDEIDVMILCGGSATDLPEQGPYFAQYFNTIDSFDTHARIPDYFDAVNAAAEQSGKVAIISVGWDPGLFSLNRLLGEVVLPVGNTYTFWGKGVSQGHSDAIRRIQGVKNAVQYTIPIDEAVNRVRSGENPELSTREKHARECFVVLEEGADPAKVEHEIKTMPNYFDEYDTTVHFISEEELKQNHSGMPHGGFVIRSGKSDEGHKQIIEFSLNLESNPMFTSSALVAYARAAYRLSQNGDKGAKTVFDIPFGLLSPKSPEDLRKELL(SEQ ID NO:1)。

優選地，上述突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:3或者SEQ ID NO:4。但本發明的D-氨基酸脫氫酶突變體不限于此。其中，D-氨基酸脫氫酶突變體SEQ ID NO:3在專利文獻CN202110108232.9中已報道過，研究發現其也可以催化α-酮異己酸反應生成D-亮氨酸。