[發(fā)明專利]一種單鏈DNA接頭及其制備和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110333136.4
• 申請(qǐng)日: 2021-03-29
• 公開（公告）號(hào): CN112941073B
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉震;楊夢(mèng)醒;鄧逸民
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/6869
• 代理公司: 武漢天領(lǐng)眾智專利代理事務(wù)所(普通合伙) 42300
• 代理人: 王能德

本發(fā)明公開了一種單鏈DNA接頭及其制備和應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)；所述單鏈DNA接頭包括一對(duì)完全互補(bǔ)的引物，所述引物的末端連接有簡(jiǎn)并堿基N，所述簡(jiǎn)并堿基N的數(shù)量為6～7個(gè)；本發(fā)明中所述單鏈DNA接頭的連接是將所述的單鏈DNA接頭的接頭Mix與單鏈DNA，在冰上等體積混合，然后在37℃水浴中孵育15～20min，即可得到連接產(chǎn)物；本發(fā)明提供了一種單鏈DNA接頭，通過一個(gè)6～7bp隨機(jī)引物組成的粘性末端，能夠與任何序列組合互補(bǔ)，該單鏈DNA接頭能夠在單鏈DNA的3'末端添加已知序列，不但適用于已知序列的單鏈DNA加接頭，還能用于含未知序列的單鏈DNA加接頭，因此在第二代測(cè)序技術(shù)中有很大的應(yīng)用潛力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種單鏈DNA接頭及其制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)

二代測(cè)序(second generation sequencing)也稱為下一代測(cè)序(nextgeneration sequencing，NGS)或大規(guī)模平行測(cè)序(massively parallel sequencing)，是一類測(cè)序技術(shù)的統(tǒng)稱。二代測(cè)序技術(shù)主要由三個(gè)流程組成，包括建庫(kù)、測(cè)序和數(shù)據(jù)處理。建庫(kù)根據(jù)不同樣本或檢測(cè)目的分為全基因組建庫(kù)、目標(biāo)區(qū)段捕獲建庫(kù)、轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)等。測(cè)序又分為邊合成邊測(cè)序(sequencing by synthesis，SBS)和邊連接邊測(cè)序(sequencing byligation，SBL)兩種策略。數(shù)據(jù)處理是將測(cè)序儀記錄的堿基信號(hào)通過序列比對(duì)、局部比對(duì)和堿基質(zhì)量校正等生物信息學(xué)處理后，用于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SNP、拷貝數(shù)變化CNV以及大片段的插入和缺失(insertion-deletion，indel)等結(jié)構(gòu)突變(structural variation，SV)的過程。

在二代測(cè)序中，DNA加接頭技術(shù)是一個(gè)非常重要的步驟。DNA加接頭技術(shù)是指將一段已知序列DNA加到另一個(gè)DNA末端的過程，常用加接頭的方法有擴(kuò)增法和接頭連接法，前者是將已知序列添加在上下游引物的5’端，然后通過PCR的方法引入接頭序列，但該方法需要知道目標(biāo)DNA兩端的序列，這有很大局限性；后者依賴聚合酶類末端轉(zhuǎn)移活性添加的A尾巴，通常需要先對(duì)DNA先進(jìn)行末端修復(fù)，然后利用T4 DNA連接酶將含有突出的粘性末端與Y型引物接頭連接。這是目前使用最廣泛的連接頭方法，但其并不適合單鏈DNA加接頭。

T4 DNALigase是分子生物學(xué)工具酶的主力軍之一，它以高效的雙鏈DNA粘性末端或平末端連接活性著稱。雖然T4 DNA Ligase也具有連接單鏈DNA-單鏈DNA連接活性，但連接效率比連接雙鏈DNA低2個(gè)數(shù)量級(jí)(Kuhn H,Frank-Kamenetskii MD.Template-independent ligation of single-stranded DNA by T4 DNA ligase.FEBS J.2005Dec；272(23):5991-6000.)，這極大限制了其在單鏈DNA加接頭中的應(yīng)用。

單鏈DNA加接頭研究不如雙鏈DNA加接頭廣泛，但對(duì)于特殊DNA測(cè)序和研究是十分重要的，比如單鏈?zhǔn)删wDNA測(cè)序、單鏈環(huán)狀病毒解析，RNA鏈被降解的cDNA分析等。T4 RNA連接酶能夠直接連接單鏈DNA間的磷酸二酯鍵，但效率較低，應(yīng)用不多。因此，單鏈DNA加接頭還面臨效率低、操作繁瑣等問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種單鏈DNA接頭及其制備和應(yīng)用，解決現(xiàn)有的單鏈DNA加接頭面臨效率低、操作繁瑣等問題。

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種單鏈DNA接頭。

所述單鏈DNA接頭包括一對(duì)完全互補(bǔ)的引物，所述引物的GC含量在50～60％之間，所述簡(jiǎn)并堿基N的數(shù)量為6～7個(gè)。

進(jìn)一步地，所述引物中的一條鏈的3’末端連接有簡(jiǎn)并堿基N，所述簡(jiǎn)并堿基中的最后一個(gè)堿基使用C3 Spacer修飾；所述引物中的另外一條鏈的3’末端和5’末端進(jìn)行磷酸化修飾。