[發明專利]一種利用生物反應器制備犬瘟熱病毒單克隆抗體的方法

在審

• 申請號: 202110329015.2
• 申請日: 2021-03-27
• 公開（公告）號: CN112725285A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 葉陽;宋新剛;張立恒;任德強;張健;孫博;麻昌姣;李蘭
• 申請（專利權）人: 哈爾濱元亨生物藥業有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/10;C12P21/08
• 代理公司: 哈爾濱龍科專利代理有限公司 23206
• 代理人: 李智慧

本發明公開了一種利用生物反應器制備犬瘟熱病毒單克隆抗體的方法，所述方法包括如下步驟：步驟一、應用有限稀釋法對雜交瘤細胞進行亞克隆，挑選單個細胞至無血清培養基中進行懸浮培養，得到細胞株10B7，保藏編號為：CGMCC No.21904；步驟二、應用生物反應器制備抗犬瘟熱病毒單克隆，其中：所述生物反應器內分細胞生長階段和抗體分泌階段兩個階段培養雜交瘤細胞；步驟三、收獲細胞培養液為抗體，進行離心去除細胞碎片，分裝產品。該方法提高了犬瘟熱病毒單克隆抗體的效價，無需濃縮，克服了傳統腹水生產抗體的缺點，使抗體產品無雜蛋白，產品穩定，批間差異小。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，涉及一種利用生物反應器制備犬瘟熱病毒單克隆抗體的方法。

背景技術

犬瘟熱（canine distemper）是犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，常引起消化道、呼吸道以及神經系統癥狀，并能引起機體免疫抑制。該病的傳染性極強，死亡率達80%以上，接種犬瘟熱疫苗是預防犬瘟熱最有效的途徑之一。近年來，在廣泛應用疫苗防治的同時，世界各地仍有犬感染犬瘟熱病毒，并有范圍內流行的報道。

單克隆抗體由細胞工程產生的鼠源單克隆抗體，由單一B細胞克隆產生的高度均一，僅針對某一特定抗原表位的抗體。最大的特點是特異性強，純度高，可擴大生產。

目前為止，犬瘟熱單克隆抗體的制備方法主要是小鼠腹腔收集，將單克隆抗體細胞注入BALB/c小鼠腹腔，細胞在內生長并產生腹水，7~10天后小鼠腹腔增大，收集腹水。此方法收集的抗體濃度高，但操作繁瑣，產量低，無法規模化生產。而且收集的腹水中會有雜蛋白，需純化并伴有污染動物病毒的危險。目前用生物反應器培養雜交瘤細胞可以規模化生產抗體并且避免動物病毒的危險。但是，生產后抗犬瘟熱病毒單抗無法達到所需效價，需要進行濃縮，受溫度、pH、料液濃縮倍數、經濟成本等影響，急需研究出應用生物反應器生產抗犬瘟熱病毒單克隆抗體且無需進行濃縮的制備方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用生物反應器制備犬瘟熱病毒單克隆抗體的方法，該方法提高了犬瘟熱病毒單克隆抗體的效價，無需濃縮，克服了傳統腹水生產抗體的缺點，使抗體產品無雜蛋白，產品穩定，批間差異小。本發明應用的培養基成分明確，具有過程和質量可控、操作簡單、生產效率高、穩定性好等優點。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種利用生物反應器制備犬瘟熱病毒單克隆抗體的方法，包括如下步驟：

步驟一、應用有限稀釋法對雜交瘤細胞進行亞克隆，挑選單個細胞至無血清培養基中進行懸浮培養，得到成活率高、抗體分泌能力強的細胞株10B7，其中：

所述雜交瘤細胞選自能夠穩定分泌抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的鼠雜交瘤細胞株，通過有限稀釋克隆，挑選出可以穩定在無血清培養基懸浮培養的細胞株10B7，分類命名為雜交瘤細胞（hybridoma），保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所，保藏編號為：CGMCCNo.21904，保藏日期為2021年2月25日；

所述懸浮培養的具體步驟如下：待亞克隆挑選后的細胞株生長至單層，細胞密度按1.2E6接種于F125搖瓶內，每天取樣計數，細胞密度按1.2E6傳代，其中，培養基用法：接種搖瓶時用含15%血清的DMEM，每次傳代用液DMEM（含15%血清）：無血清培養基的比例為1:3，1:1，3:1依次遞減DMEM（含15%血清）用量；

步驟二、應用生物反應器制備抗犬瘟熱病毒單克隆，其中：

所述生物反應器內分細胞生長階段（即：培養細胞增殖）和抗體分泌階段兩個階段培養雜交瘤細胞，將收獲的細胞液進行離心分離，無需濃度制得抗犬瘟熱病毒單克隆抗體成品；

所述細胞生長階段為以獲得細胞數為主，抗體分泌階段以持續穩定的獲得大量分泌抗體為主；