[發明專利]一種提高草原龍膽基因編輯效率的重組載體及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 202110326289.6
• 申請日: 2021-03-26
• 公開（公告）號: CN113136397B
• 公開（公告）日: 2022-05-20
• 發明（設計）人: 張旸;李雪奇;李玉花
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/40
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 王志新

本發明提供了一種提高草原龍膽基因編輯效率的重組載體及其制備方法與應用，屬于生物技術領域。為了提高草原龍膽基因的編輯效率。提高草原龍膽基因編輯效率的重組載體的構建方法是以pGmU6?GmCRISPR/Cas9載體為原始載體，以草原龍膽的截短EgU6啟動子替換原始載體的U6啟動子，連接待編輯的草原龍膽基因的SgRNA序列或者以含有Cas9的表達載體1300為原始載體，按順序依次連接EgU6啟動子、待編輯的草原龍膽基因的SgRNA和gRNAscaffold得到重組片段，將重組片段與含有Cas9的表達載體1300連接。草原龍膽高效基因編輯載體為草原龍膽基因功能的研究及新品種的開發提供重要的技術平臺。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種提高草原龍膽基因編輯效率的重組載體及其制備方法與應用。

背景技術

草原龍膽(Eustoma grandiflorum)，又名洋桔梗(Lisianthus)，其株態輕盈，花色典雅，多用于鮮切花和盆栽觀賞。原產美國內布拉斯加州，后被日本引種，增添了一些花色和花型的變化使得它成為了目前國際上十分流行的鮮切花的種類之一。草原龍膽作為一種觀賞花卉以及鮮切花，其花期、花的保鮮度以及抵抗各種脅迫的能力極為重要，尤其是抗旱保水方面，因此相應的基因調控網絡的研究顯得尤為重要。在早期的植物基因組功能的研究主要是靠自然突變獲得的材料，但是這種材料的獲得十分困難也十分的稀少。后來隨著基因組測序技術的漸漸成熟，科學家在研究基因的生物學功能時采用反向遺傳學技術，主要包括T-DNA的插入、RNA介導的基因沉默、RNA干涉以及基于EMS的定向誘導基因組局部突變技術(Tilling技術)，但是這些方法獲得的突變往往存在著許多的不足，有的產生的基因的突變是隨機的，例如T-DNA的插入；有的方法產生的基因的沉默不具有穩定性，例如RNA干涉，因此新一代研究基因組功能的技術應運而生，其中第三代基因組編輯技術即CRISPR/Cas9技術迅速發展起來，人們可以按照自己的意愿定向的改變物種基因組的序列，能對基因組完成精確的修飾，可對基因產生定點的堿基對的替換、增添或小片段的缺失，為基因功能的研究提供了重要的方法，同時其廣泛應用大大促進了科研、農業、基礎醫學及臨床治療的發展。

發明內容

本發明的目的是為了提高草原龍膽基因的編輯效率，為了解決上述技術問題本發明提供了一種提高草原龍膽基因編輯效率的重組載體，所述重組載體以pGmU6-GmCRISPR/Cas9載體為原始載體，以草原龍膽(Eustoma grandiflorum)的截短EgU6啟動子替換原始載體的U6啟動子，然后連接待編輯的草原龍膽基因的SgRNA序列，即得到重組載體或者所述重組載體以含有Cas9的表達載體1300為原始載體，然后按順序依次連接截斷EgU6啟動子、待編輯的草原龍膽基因的SgRNA和gRNA scaffold序列得到重組片段，最后將重組片段與含有Cas9的表達載體1300連接，即得到重組載體。

進一步地限定，所述重組載體以pGmU6-GmCRISPR/Cas9載體為原始載體，然后將草原龍膽的截短EgU6啟動子與待編輯的草原龍膽基因的SgRNA序列連接得到重組序列，將所述重組序列與原始載體進行同源重組反應，即得到重組載體。進一步地限定，所述重組片段的連接方法如下：