[發明專利]一種GNP多肽的檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 202110323911.8
• 申請日: 2021-03-26
• 公開（公告）號: CN112710852B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 章登吉;陳春麟;任朋亮;周舟揚;張路路;章春燕
• 申請（專利權）人: 上海美迪西生物醫藥股份有限公司;美迪西普勝醫藥科技（上海）有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543;G01N33/535
• 代理公司: 上海瀚橋專利代理事務所(普通合伙) 31261
• 代理人: 鄭優麗;牛彥存

本發明公開一種GNP多肽的檢測試劑盒及檢測方法。所述檢測試劑盒包括：組分A：預先包被鏈霉親和素的微孔酶標板；組分B：GNP免疫小鼠單克隆抗體腹水或者純化的GNP單克隆抗體；組分C：生物素偶聯的GNP多肽；組分D：用于稀釋純化的GNP單克隆抗體或者GNP免疫小鼠單克隆抗體腹水的樣品稀釋液；組分E：用于稀釋生物素偶聯的GNP多肽的分析緩沖液；組分F：GNP標準品；組分G：辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG；組分H：用于稀釋辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG的抗體稀釋液；組分G：TMB底物；組分I：終止液。本發明基于有限的抗原表位構建競爭性的分析方法，成功構建了GNP多肽的檢測試劑盒。

技術領域

本發明屬于藥物分析領域，涉及GNP多肽的藥代動力學和毒代動力學研究領域，具體涉及一種GNP多肽的檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術

GNP多肽，也可以稱為“G型利鈉肽”或者“GNP”，最初在非洲東部地區的一種窄頭樹眼鏡蛇毒液中發現，是與BNP相似的天然類似物，也是利鈉肽家族的新成員，具有極高藥用價值。GNP多肽的一級結構中含有38個氨基酸序列，分子量約為3689Da。GNP比BNP相差6個氨基酸，且同源性差異很大，僅48.3%的同源性，但是可以發揮類似于BNP的作用，例如增加靶細胞環鳥苷酸的水平，促進平滑肌細胞舒張，促使靜脈和動脈血管擴張，發揮利尿鈉、利尿、血管擴張、平滑肌松弛的作用。目前國內外許多藥物公司開發GNP多肽，且主要通過合成途徑制作GNP多肽。但是當前尚未有相關報道涉及GNP多肽的檢測方法，市場上也沒有提供對應的GNP多肽檢測試劑盒。基于GNP多肽藥物分子的研發需求，構建GNP多肽的檢測試劑盒及檢測方法迫在眉睫。

如上所述，GNP是新發現的外源性多肽分子，GNP與內源的BNP相比不僅相差了6個氨基酸數目，而且序列上同源性很小，僅48.3%的同源性，無表位重疊性可言，GNP和BNP在來源和結構上的差異都決定BNP的檢測對GNP完全無可參照性。另有腦利鈉肽前體是BNP的前體物質，與GNP也屬于不一樣的功能物質，其氨基酸數目是76個，遠遠大于GNP，分子量大，潛在表位相對多，因此對腦利鈉肽前體而言容易制備純化抗體，更可以構建雙抗體夾心的檢測模式。但是本發明針對的GNP多肽是小肽，氨基酸數目相較GNP前體肽而言少一半，GNP多肽和腦利鈉肽前體無論是來源、結構大小、檢測試劑開發難易均也不具備可比擬性和參照性。總之，本發明是要針對一個新的非內源性來源的多肽構建檢測試劑盒和檢測方法。

發明內容

GNP檢測試劑盒的開發完全是針對一個不同的新的肽類分子。無論是抗體制備純化、分子標記，還是檢測緩沖液（Assay Format）的構建都是所要面臨的全新技術性問題和實施過程中必須克服的技術性挑戰。總體而言，當前構建GNP多肽的檢測試劑盒及檢測方法主要存在以下技術問題：

（1）GNP主要用于治療心腦血管類疾病，給藥劑量很低，通常是ug/kg級別，因此GNP多肽的檢測試劑盒對靈敏度要求極高，需要達到納克級以下，且檢測方法在藥物分析實踐中需要涵蓋多個半衰期，還要兼顧小動物實驗中樣品量少的特點。

（2）GNP作為小肽物質，不穩定性突出，尤其是未經任何修飾的GNP裸肽在血液和緩沖液（例如分析緩沖液）中極不穩定，故在檢測試劑盒的構建過程中需要克服其不穩定性。

（3）GNP僅含38個氨基酸，屬于很短的小肽，表位非常有限，對其標記存在極高難度，相應的抗體也難以制備，這使得雙抗體夾心法難以用于GNP檢測試劑盒的構建，這無疑進一步增加了使得該檢測試劑盒實現良好檢測效果的難度。

針對上述問題，本發明提供一種GNP多肽的檢測試劑盒及檢測方法，既可以達到很高的靈敏度，提高信號，還可以在樣品用量少于常規用量（50~100μL）的情況下，獲得良好的檢測效果。

第一方面，本發明提供一種GNP多肽的檢測試劑盒。所述檢測試劑盒包括：

組分A：預先包被鏈霉親和素的微孔酶標板；