[發(fā)明專利]定量分析肉制品中牛源性成分的引物組及其應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2021-03-25
• 公開（公告）號: CN112921103A
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬炳存;崔學(xué)文;李琰歆;賀巧玲;曹乾超;劉陽;陳學(xué)強(qiáng);王燦;李增婷
• 申請（專利權(quán)）人: 四川省食品藥品檢驗檢測院（四川省藥品質(zhì)量研究所;四川省醫(yī)療器械檢測中心）
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 重慶市信立達(dá)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50230
• 代理人: 包曉靜

本發(fā)明涉及食品檢驗技術(shù)領(lǐng)域，公開了定量分析肉制品中牛源性成分的引物組，包括ref引物和beef引物，ref引物包括ref上游引物、ref下游引物和ref探針，beef引物包括beef上游引物、beef下游引物和beef探針；還公開了引物組的應(yīng)用。本發(fā)明的ref引物在肌肉生長抑制素基因全長序列中存在唯一的特異性結(jié)合位點(diǎn)，beef引物在環(huán)GMP磷酸二酯酶基因全長序列中存在唯一的特異性結(jié)合位點(diǎn)，上述檢測引物能夠特異性擴(kuò)增靶基因，為制備用于定量分析肉制品中的牛源性成分的試劑盒提供了特異性檢測引物，在檢測過程中可有效區(qū)分產(chǎn)品交叉污染、原料帶入和生產(chǎn)者惡意摻假造成的陽性檢測結(jié)果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及食品檢驗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及定量分析肉制品中牛源性成分的引物組及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

我國及歐盟食品標(biāo)準(zhǔn)均要求肉制品包裝中應(yīng)明確標(biāo)識產(chǎn)品中動物源成分組成及含量，但市場上肉制品中動物源性成分含量虛標(biāo)、摻假事件屢禁不止。肉制品摻假給消費(fèi)者的身體健康(過敏反應(yīng))、宗教信仰等方面均帶來了風(fēng)險。在肉類摻假形式層出不窮的情勢下，對動物源性成分定性、定量鑒別技術(shù)的研究成為食品安全領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

目前使用的動物源性成分鑒定分析方法主要基于蛋白質(zhì)和DNA分析。蛋白質(zhì)分析技術(shù)包括免疫、色譜和質(zhì)譜，肉制品加工過程中的熱處理工藝、酸堿鹽環(huán)境變化使蛋白質(zhì)變性，生物活性喪失，很難滿足檢測的需要，且親緣關(guān)系較近的物種蛋白質(zhì)分析易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，限制了蛋白質(zhì)分析技術(shù)在這一領(lǐng)域的應(yīng)用。基于DNA分析的檢測方法可以克服這些困難，DNA的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性優(yōu)于蛋白質(zhì)，并且DNA有更豐富的種間多態(tài)性，高溫處理過的食品中仍能提取出片段化的DNA，在深加工肉制品的鑒別檢測中DNA分析方法具有靈敏度高和特異性強(qiáng)的明顯優(yōu)勢。但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的檢測方法主要存在以下局限性：第一，只能進(jìn)行定性檢測，無法完成定量分析；第二，檢測靈敏度過高，在檢測過程中，無法排除在生產(chǎn)、儲存、運(yùn)輸、銷售等過程中樣品交叉污染或原料帶入所帶來的陽性結(jié)果，很難為市場監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐。

現(xiàn)行檢測技術(shù)無法定量分析樣品中動物源性成分的根本原因在于檢測使用的引物和探針是針對線粒體基因設(shè)計的。線粒體基因進(jìn)化速度快，對物種的區(qū)分度較高，常用于物種的細(xì)致分類，研究生物的進(jìn)化過程。但是，線粒體基因在不同組織細(xì)胞中拷貝數(shù)不同，因此針對線粒體DNA的檢測方法只能進(jìn)行定性檢測，無法完成定量分析；線粒體的拷貝數(shù)普遍較高，以線粒體基因作為檢測靶位進(jìn)行檢測時靈敏度過高，在檢測過程中，無法區(qū)分產(chǎn)品交叉污染、原料帶入和生產(chǎn)者惡意摻假造成的陽性檢測結(jié)果。以細(xì)胞核染色體基因組中單拷貝基因作為檢測靶位設(shè)計引物和探針，建立動物源性成分定量分析方法，可以克服現(xiàn)有定性檢測方法的缺點(diǎn)。因此，發(fā)明人研發(fā)了定量分析肉制品中牛源性成分的引物組及其應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

基于以上問題，本發(fā)明提供定量分析肉制品中牛源性成分的引物組及其應(yīng)用，本發(fā)明的ref引物在肌肉生長抑制素基因(GDF8基因)全長序列中存在唯一的特異性結(jié)合位點(diǎn)，beef引物在環(huán)GMP磷酸二酯酶基因(PDE基因)全長序列中存在唯一的特異性結(jié)合位點(diǎn)，上述檢測引物能夠特異性擴(kuò)增靶基因，為定量分析肉制品中的牛源性成分提供了特異性檢測引物，在檢測過程中可有效區(qū)分產(chǎn)品交叉污染、原料帶入和生產(chǎn)者惡意摻假造成的陽性檢測結(jié)果。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

定量分析肉制品中牛源性成分的引物組，其特征在于，包括ref引物和beef引物，ref引物用于特異性擴(kuò)增脊椎動物肉制品中的GDF8基因，beef引物用于特異性擴(kuò)增?？苿游锘蚪M中的PDE基因；

ref引物包括ref上游引物、ref下游引物和ref探針，beef引物包括beef上游引物、beef下游引物和beef探針；

所述ref上游引物的核苷酸序列見SEQ ID No.4，所述ref下游引物的核苷酸序列見SEQ ID No.5，所述ref探針的核苷酸序列見SEQ ID No.6；