[發(fā)明專(zhuān)利]一種利用鈍齒棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)1,4-丁二胺的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110317317.8
• 申請(qǐng)日: 2021-03-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113061562B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-09-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐美娟;饒志明;楊鳳玉;楊套偉;張顯
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12N15/77;C12P13/00;C12R1/15
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發(fā)明公開(kāi)了一種利用鈍齒棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)1,4?丁二胺的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。通過(guò)大腸桿菌和鈍齒棒桿菌之間的穿梭質(zhì)粒pXMJ19，將精氨酸脫羧酶編碼基因經(jīng)突變后與胍丁胺酶編碼基因串聯(lián)成功并在精氨酸高產(chǎn)菌株中過(guò)表達(dá)。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明，原始菌不具有生產(chǎn)有活性的精氨酸脫羧酶和胍丁胺酶的能力，而重組工程菌可以完成L?精氨酸到1,4?丁二胺的轉(zhuǎn)化。同時(shí)基于此基因工程菌株具有高產(chǎn)L?精氨酸的特性，成功采用一步發(fā)酵法以葡萄糖為底物生產(chǎn)1,4?丁二胺。本發(fā)明方法生產(chǎn)1,4?丁二胺，具有效率高、副產(chǎn)物L(fēng)?精氨酸、胍基丁胺和其他雜酸余量低的優(yōu)點(diǎn)，后期對(duì)于產(chǎn)物1,4?丁二胺的分離純化更加容易。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用鈍齒棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)1,4-丁二胺的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

1,4-丁二胺(也稱(chēng)1,4-二氨基丁烷或腐胺)屬于氨基酸衍生物，作為聚合物，藥物，農(nóng)用化學(xué)品，表面活性劑和其他添加劑的組分，具有許多工業(yè)應(yīng)用。由于它作為合成高性能聚酰胺尼龍-4,6的單體而倍受關(guān)注，尼龍-4,6因其高熔點(diǎn)、高結(jié)晶度、高耐熱性和高機(jī)械強(qiáng)度以及出色的耐溶劑性而成為一種優(yōu)異的工程塑料。因此，1,4-丁二胺具有十分廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

工業(yè)規(guī)模上1,4-丁二胺的生產(chǎn)主要是采用琥珀腈加氫的化學(xué)合成法，琥珀腈通過(guò)在丙烯腈中添加氰化氫產(chǎn)生。化學(xué)路線(xiàn)需要不可再生的石油化工產(chǎn)品作為原材料和相對(duì)苛刻的反應(yīng)條件，以及昂貴的催化劑。由于反應(yīng)物具有劇毒和易燃性，因此從環(huán)境和人類(lèi)健康的角度來(lái)看，化學(xué)合成路線(xiàn)并不可取。

而目前具有應(yīng)用前景的生物法制備1,4-丁二胺的方法主要是酶轉(zhuǎn)化法，酶法轉(zhuǎn)化有兩種路徑：1、利用精氨酸脫羧酶與胍丁胺酶串聯(lián)表達(dá)將精氨酸轉(zhuǎn)化為1,4-丁二胺；2、利用鳥(niǎo)氨酸脫羧酶將鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)化為1,4-丁二胺。與化學(xué)合成法相比，利用酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1,4-丁二胺具有步驟簡(jiǎn)單、副產(chǎn)物少以及綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，但是酶法轉(zhuǎn)化需要以?xún)r(jià)格昂貴的精氨酸或鳥(niǎo)氨酸為底物，具有成本高的缺陷，這大大阻礙了酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1,4-丁二胺的工業(yè)化進(jìn)程。

雖然現(xiàn)有報(bào)道當(dāng)中，有采用葡萄糖直接合成1,4-丁二胺，但是最終產(chǎn)量不高、產(chǎn)率低等缺點(diǎn)，例如：Volker F.Wendisch等人研究公開(kāi)的方法中，是采用通過(guò)優(yōu)化啟動(dòng)子和RBS元件，建立了ArgF精確調(diào)控策略的技術(shù)方案，但是生成的1,4-丁二胺的產(chǎn)量?jī)H為19g·L^-1，并且存在產(chǎn)率低等缺點(diǎn)，僅有0.16g·g^-1葡萄糖(記載于“Improving putrescineproduction by Corynebacterium glutamicum by fine-tuning ornithinetranscarbamoylase activity using a plasmid addiction system”論文中)；JianZhongLiu等人研究公開(kāi)的方法中，是通過(guò)過(guò)表達(dá)CgmA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并系統(tǒng)集成前體合成模塊和OdhA調(diào)控模塊的強(qiáng)度優(yōu)化的技術(shù)方案，使得生產(chǎn)率達(dá)到0.29g·g^-1葡萄糖，但是生成的1,4-丁二胺的產(chǎn)量?jī)H為12.4g·L^-1(記載于“Metabolic evolution and a comparative omicsanalysis of Corynebacterium glutamicum for putrescine production”論文中)。

為此，創(chuàng)造以廉價(jià)葡萄糖為底物直接合成高價(jià)值1,4-丁二胺的綠色合成路線(xiàn)十分重要，并且，如何提高以葡萄糖為底物合成1,4-丁二胺的產(chǎn)量成為研究的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問(wèn)題：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可低成本且高效合成1,4-丁二胺的重組菌株及其構(gòu)建方法，及提供一種能夠以葡萄糖為底物高產(chǎn)1,4-丁二胺的方法。

技術(shù)方案：

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種重組鈍齒棒桿菌，所述重組鈍齒棒桿菌同時(shí)表達(dá)了精氨酸脫羧酶突變體A533P和胍丁胺酶。