[發明專利]一種用于檢測農藥小分子的整合酶的制備方法

有效

• 申請號: 202110295061.5
• 申請日: 2021-05-12
• 公開（公告）號: CN113109270B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發明（設計）人: 李穎;包敏;李淑娟;陳雨潔;劉松琴
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: G01N21/25
• 分類號: G01N21/25;G01N21/78;C12N9/18;B01J31/26;B01J23/52;B01J27/24;B01J37/08;B01J37/03;B01J37/00;B01J37/16
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

本發明公開了一種用于檢測農藥小分子的整合酶的制備方法。首先，我們利用表面積大、孔體積大、化學穩定性好、熱穩定性好的類沸石咪唑酯骨架制備具有類過氧化物酶活性的多孔碳材料，用于負載同樣具備類過氧化物酶活性的亞納米級的金簇，進而制備納米復合模擬酶。多孔碳材料和金簇之間的協同催化作用、金簇的小尺寸效應及碳材料納米孔的限域效應共同增強了納米復合模擬酶的催化活性。然后，我們將乙酰膽堿酯酶和納米復合模擬酶進行共價整合，制備成整合酶，提高了乙酰膽堿酯酶的活性和穩定性。與此同時，借助納米復合模擬酶的高類過氧化物酶活性，利用其與乙酰膽堿脂酶之間的仿生級聯催化策略，成功構建了用于檢測農藥小分子的高效比色傳感器。

技術領域

本發明屬于材料制備技術領域，尤其涉及一種用于檢測農藥小分子的整合酶的制備方法。

背景技術

有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑常用來解決農業作物的病蟲害問題。然而，農藥殘留會造成環境污染，威脅人類健康。農藥殘留檢測的傳統方法是氣質聯用色譜，液質聯用色譜和毛細管電泳等。但是，這些方法檢測周期長、檢測成本高。因此，有必要開發一種快速可靠的方法來檢測有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑，以進行公共食品安全和環境檢測。酶抑制法利用殺蟲劑對酶催化活性的抑制作用，可用于快速檢測有機磷，氨基甲酸酯類等。目前最廣泛使用的酶類為乙酰膽堿酯酶，然而其穩定性不足且價格昂貴，嚴重限制了其實際應用。最近，有研究報道將乙酰膽堿酯酶固定在電極材料上構建電化學傳感器檢測有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑(Electrochim.Acta,2019,318,525-533)。近年來，基于過氧化物酶和游離乙酰膽堿酯酶之間的級聯催化反應構建的比色傳感器引起了人們的廣泛關注。與電化學方法相比，比色法成本低廉，能直觀檢測分析物(Anal.Chem.,2014,86,514-520)。但是，這種方法仍然存在游離乙酰膽堿酯酶和過氧化物酶不穩定的問題。

發明內容

發明目的：本發明的目的在于提供一種保持游離的乙酰膽堿酯酶活性、提高其穩定性，實現有機磷等農藥小分子快檢的整合酶的制備方法。

技術方案：本發明的用于檢測農藥小分子的整合酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)合成類沸石咪唑酯骨架材料-8；

(2)將類沸石咪唑酯骨架材料-8分散于甲醇水溶液中，調節pH，再加入十六烷基三甲基溴化銨，攪拌反應后，加入正硅酸乙酯，攪拌反應，離心，洗滌，真空干燥得到介孔二氧化硅包覆的沸石咪唑酯骨架材料-8；

(3)將介孔二氧化硅包覆的沸石咪唑酯骨架材料-8置于管式爐中煅燒得到介孔二氧化硅包覆的氮摻雜碳納米材料；

(4)將介孔二氧化硅包覆的氮摻雜碳納米材料利用氫氟酸進行刻蝕得到氮摻雜碳納米材料；

(5)將合成得到的氮摻雜碳納米材料作為基底，將其分散于溶劑中，超聲分散后在劇烈攪拌下加入氯金酸，通過化學試劑或物理法進行還原，反應后過濾、洗滌，真空干燥得到納米復合模擬酶；

(6)將合成得到的納米復合模擬酶分散到溶劑中并加入3-巰基丙酸，震蕩反應后，離心，洗滌，得到的產物重新分散，并取一定量的分散液向其中加入2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽活化羧基，反應后離心，得到的產品分散后，再加入三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液和乙酰膽堿酯酶制備得到整合酶。

進一步地，步驟(1)中，所述合成類沸石咪唑酯骨架材料-8的方法包括以下步驟：

(a)取摩爾比為1:2～1:10的六水合硝酸鋅和2-甲基咪唑，分散在甲醇中攪拌反應1～24h，攪拌速度為攪拌的速度為500～1500rpm；

(b)反應后離心分離，并通過甲醇洗滌3～5次，其中離心分離的轉速為5000～13000rpm；

(c)洗滌后的產物在60～120℃下真空干燥24～48h，得到類沸石咪唑酯骨架材料-8。