[發(fā)明專利]一種適用于發(fā)酵食品的多銅氧化酶重組酶

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110292596.7
• 申請日: 2021-03-18
• 公開（公告）號: CN112921010B
• 公開（公告）日: 2023-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 方芳;倪秀梅;房峻;陳堅;堵國成
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/74;C12N1/21;A23L5/20;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發(fā)明公開了一種適用于發(fā)酵食品的多銅氧化酶重組酶，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明中將不同來源的多銅氧化酶基因及其優(yōu)良突變體基因在乳酸乳球菌食品級表達(dá)系統(tǒng)NZ3900/pNZ8149中成功表達(dá)，并通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件，使得重組野生型多銅氧化酶MCOB和突變體L386Y、L386Y/T317N、L386Y/T317N/S427E的表達(dá)水平分別達(dá)到了2325.84U/L、4488.06U/L、4289.78U/L、2254.45U/L。將乳酸乳球菌食品級表達(dá)的多銅氧化酶用于生物胺的降解，可使多銅氧化酶對組胺的降解能力提高了63.41％，可以作為安全的食品添加劑應(yīng)用于發(fā)酵食品降解生物胺。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種適用于發(fā)酵食品的多銅氧化酶重組酶，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

生物胺是生物體內(nèi)產(chǎn)生的一類低分子量含氮有機(jī)化合物的總稱，是發(fā)酵食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中的一個限制性指標(biāo)。適量的生物胺可以促進(jìn)人體正常的生理活動，但通過食物攝入過量生物胺則會引起偏頭痛，頭痛，胃和腸道問題以及假性過敏反應(yīng)等不良反應(yīng)，嚴(yán)重時可能危及生命。因此，需要將其在發(fā)酵食品中的含量降至合適的濃度。

目前用于控制和減少發(fā)酵食品中生物胺的措施主要可分為三種：1、源頭減控。對生產(chǎn)原料進(jìn)行優(yōu)化，減少原料中的蛋白質(zhì)，控制游離氨基酸的數(shù)量，這種方法可以減少生物胺的生成。其弊端在于這種方法極大可能會對產(chǎn)品風(fēng)味和品質(zhì)造成較大影響。其它方法如減少發(fā)酵體系中產(chǎn)胺的微生物一般僅適用于封閉的單菌體系發(fā)酵，對于混菌體系或者開放體系(易染菌)效果不大。2、過程減控。這涉及到改進(jìn)食品加工方法，對發(fā)酵條件(如發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、pH等條件)進(jìn)行優(yōu)化以及添加外源抑制劑等來減少因菌株代謝及酶促反應(yīng)而生成的胺前體物質(zhì)，從而達(dá)到抑制胺產(chǎn)生的目的。但即使改變發(fā)酵條件，依然會有生物胺生成，且產(chǎn)品的加工溫度和鹽度等因素多由食物特性決定，而低溫貯藏會提高設(shè)備和能耗費(fèi)用。3、末端減控，也稱為酶法減控。這種方法可以消除已生成的生物胺，且基本不用調(diào)整和改變食品發(fā)酵工藝，對食品營養(yǎng)和風(fēng)味的影響也較小，是目前最具有應(yīng)用前景的方法。

多銅氧化酶(MCO)家族的某些酶可以降解食品中的胺類危害物生物胺，但因酶的產(chǎn)量低、催化能力有限等因素從而造成了酶對生物胺的降解率低；食品酶的添加必須符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)，所用生產(chǎn)菌株必須安全，工程菌不能使用任何抗性篩選標(biāo)記，這些因素也限制了多銅氧化酶在實(shí)際中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種適用于發(fā)酵食品的多銅氧化酶重組酶。

本發(fā)明提供了一種多銅氧化酶突變體，是在SEQ?ID?NO.5所示氨基酸序列的基礎(chǔ)上，對第317位、386位、427位的至少一個氨基酸進(jìn)行了突變。

在一種實(shí)施方式中，所述多銅氧化酶突變體是在SEQ?ID?NO.5所示氨基酸序列的基礎(chǔ)上，將第317位蘇氨酸(T)突變?yōu)樘於０?N)。

在一種實(shí)施方式中，所述多銅氧化酶突變體是在SEQ?ID?NO.5所示氨基酸序列的基礎(chǔ)上，將第386位亮氨酸(L)突變?yōu)槔野彼?Y)。

在一種實(shí)施方式中，所述多銅氧化酶突變體是在SEQ?ID?NO.5所示氨基酸序列的基礎(chǔ)上，將第427位絲氨酸(S)突變?yōu)楣劝彼?E)。

在一種實(shí)施方式中，所述多銅氧化酶突變體是在SEQ?ID?NO.5所示氨基酸序列的基礎(chǔ)上，將第317位蘇氨酸(T)突變?yōu)樘於０?N)，并將第386位亮氨酸(L)突變?yōu)槔野彼?Y)。

在一種實(shí)施方式中，所述多銅氧化酶突變體是在SEQ?ID?NO.5所示氨基酸序列的基礎(chǔ)上，將第317位蘇氨酸(T)突變?yōu)樘於０?N)，并將第386位亮氨酸(L)突變?yōu)槔野彼?Y)，并將第427位絲氨酸(S)突變?yōu)楣劝彼?E)。

本發(fā)明還提供了編碼所述多銅氧化酶突變體的基因。

本發(fā)明還提供了攜帶所述基因的表達(dá)載體。