[發明專利]檢測KISS1基因突變的方法和引物

在審

• 申請號: 202110292407.6
• 申請日: 2021-03-18
• 公開（公告）號: CN112852955A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 牛林梅;劉趙玲;王淑一
• 申請（專利權）人: 杭州艾迪康醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黃素萍;徐關壽

本發明公開了檢測KISS1基因C242G、417delA、437insT和C487G堿基突變的方法、引物和試劑盒，采用Touch?down PCR擴增技術和Sanger測序技術，可用于快速檢測患者體內KISS1基因C242G、417delA、437insT和C487G位點突變情況。利用本發明的試劑盒進行檢測的結果準確，對IHH有輔助診斷價值且對惡性腫瘤的轉移可能有預測作用。

技術領域

本發明屬分子診斷領域，特別涉及KISS1基因突變的檢測引物和方法。

背景技術

KISS1基因定位在人類染色體1q32-41，由4個外顯子和3個內含子構成。在人正常組織中胎盤表達KISS1最高，其次是睪丸、胰腺、肝臟和小腸等。KISS1及其受體GPR54基因在中樞神經系統和生殖器官中廣泛表達，與生殖功能密切相關。KISS1編碼的Kisspeptin蛋白可激活促性腺激素釋放激素(GnRH)神經元，有力地促進促性腺激素釋放激素(GnRH)的釋放，調控青春期的啟動和生殖。研究發現KISS1/GPR54基因突變的個體會引起特發性低促性腺激素性性腺功能減退癥(idiopathic hypogonadotropic hypogonadism,IHH)，該病臨床表現為青春期不啟動或發育不完全，性激素水平低下而促性腺激素為正常低限或低于正常。

KISS1編碼的一個主要的蛋白是轉移抑素(Metastin，Kiss肽)，具有抗腫瘤轉移的作用。研究發現KISS1的表達水平與多種癌癥的轉移能力呈負相關關系。研究發現在人黑色素轉移瘤及高轉移黑色素瘤細胞株中KISS1 mRNA表達缺失非常常見，提示KISS1的缺失與黑色素瘤的進展和轉移密切相關。此外，研究者在乳腺癌、肝癌及甲狀腺癌中也發現了相類似的表現，在轉移程度高的癌癥組織中KISS1表達缺失嚴重。KISS1基因抗腫瘤轉移的機制可能與其抑制腫瘤細胞增殖、遷移及克隆形成能力有關，此外也與抑制MMP-9活性有關。

KISS1/GPR54系統在生殖調控中發揮關鍵作用，可高效促進GnRH的釋放，推動青春期的啟動，維持哺乳動物的生殖功能。此外KISS1的表達與惡性腫瘤的轉移密切相關。檢測KISS1基因的基因突變對IHH的早期診斷、早期治療有輔助作用，且對腫瘤轉移可能有預測功能。

發明內容

本發明的目的是提供一個檢測KISS1基因C242G、417delA、437insT和C487G位點突變的試劑盒，采用Touch-down PCR結合Sanger測序技術，可用于快速檢測患者體內KISS1基因C242G、417delA、437insT和C487G位點的突變情況。所述檢測KISS1基因C242G、417delA、437insT和C487G位點突變的引物，其特征在于，包括：擴增KISS1基因C242G、417delA、437insT和C487G位點的引物，其堿基序列為：

KISS1-F:TGTAAAACGACGGCCAGTAAGGAAGGAAAAGAAGGATAGGAT

KISS1-R:AACAGCTATGACCATGGCCTCTTGAAATCAGCTAACCA。

進一步地，還包括測序引物，其堿基序列為：

M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13 R：AACAGCTATGACCATG。

本發明還提供了檢測KISS1基因C242G、417delA、437insT和C487G位點突變情況的方法，包括以下步驟：

(1)抽提外周血中的基因組DNA；

(2)用PCR擴增步驟1中提取的DNA；

(3)對步驟2中的擴增產物進行測序；

(4)對測序結果進行判斷，確定KISS1基因C242G、417delA、437insT和C487G位點是否發生突變；