[發明專利]一種用于人糞便病原微生物基因組建庫的試劑盒和測序方法

在審

• 申請號: 202110275849.X
• 申請日: 2021-03-15
• 公開（公告）號: CN113046414A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 楊俊;趙應洪;盧東培;張澤龍
• 申請（專利權）人: 廣州君瑞康生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C40B50/06
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;朱聰聰

本發明公開了一種用于人糞便病原微生物基因組建庫的試劑盒和測序方法。本發明的用于人糞便中的病原微生物基因組建庫的核酸提取試劑盒，包括：核酸釋放劑Lysis A、增強劑Lysis Enhancer、去抑制劑IRT、結合液Binding Buffer、洗滌液1和洗滌液2。本發明對核酸提取環節進行了優化，所提DNA純度高、得率高，以保證即使在樣本量有限的情況下，下游試驗的正常進行。同時對PCR擴增條件進行優化，降低了DNA建庫的起始量，提高了建庫成功率，降低了PCR擴增偏向性，縮短了建庫周期，克服了現有建庫方法對模板起始量要求高，容易出現偏向性，建庫周期長等痛點。

技術領域

本發明屬于DNA提取和建庫領域，具體涉及一種用于人糞便病原微生物基因組建庫的試劑盒和測序方法。

背景技術

傳統的診斷病人感染性疾病的臨床模式是由醫生制定鑒別診斷，然后進行一系列測試，試圖找出病因。臨床樣品中病原體常規檢測的范圍包括鑒定培養中生長的微生物(例如，通過生化表型檢測或基質輔助激光解吸/電離(MALDI)飛行時間質譜法)，檢測生物體特異性生物標記物(例如抗原用乳膠凝集試驗或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)抗體試驗或用PCR對單個試劑進行核酸試驗。這些通常包括與確定的臨床綜合征有關的最常見病原體，如腦膜炎和腦炎、急性呼吸道感染、敗血癥或腹瀉病。

雖然分子診斷分析為診斷最常見的感染提供了一種相當經濟有效和快速的方法(通常＜2h的周轉時間)。然而，目前使用的幾乎所有常規微生物試驗一次只能檢測一種或有限的病原體，或者要求從臨床樣本中成功培養微生物。

幸運的是，全新的病原學診斷技術mNGS(宏基因組學二代測序)將有望解決這一難題，mNGS是一種對臨床樣本中的所有核酸進行測序，然后與各個物種的基因組序列對比，從而尋找可能病原體的方法。mNGS不僅可以大大縮短標本周轉時間，還能及時為臨床提供準確有利的診療依據。

目前，mNGS作為最重要的分子生物學分析方法之一，不僅為遺傳信息的揭示和基因表達調控等基礎生物學研究提供重要數據，而且在基因診斷和基因治療等應用研究中也發揮著重要的作用。自2005年以來，以Roche公司的454技術、Illumina公司的Solexa技術和ABI公司的SOLiD技術為標志的高通量測序技術的相繼誕生和發展。mNGS實現測序，通常通過下面三個步驟：1)通過PCR擴增技術獲得含待測定區域的核酸分子；2)在含待測定目標區域的核酸分子的兩端分別連接不同的接頭分子，獲得測定文庫；3)通用引物擴增連接產物，達到測序要求的量。

但是，對于一些珍貴的樣本往往提取獲得的核酸量非常有限，常常經過去宿主等步驟處理，樣本核酸量無法滿足上機要求，通過PCR擴增，增加PCR循環數，加重擴增偏向性，導致對于部分GC含量高的細菌的鑒定，出現嚴重問題，菌種豐度比例嚴重失衡。同時，部分建庫試劑盒存在周期過長等問題。

鑒于此，現有技術中仍亟需一種新的快速的適用于微量臨床建庫方法簡化實驗步驟，提高建庫效率。

發明內容

本發明提供一種用于人糞便中的病原微生物基因組建庫的試劑盒和測序方法，本發明對核酸提取環節進行了優化，所提DNA純度高、得率高，以保證即使在樣本量有限的情況下，下游試驗也能正常進行。同時對PCR擴增條件進行優化，降低了DNA建庫的起始量，提高了建庫成功率，降低了PCR擴增偏向性，縮短了建庫周期，克服了現有建庫方法對模板起始量要求高，容易出現偏向性，建庫周期長等痛點。

本發明的第一個目的是提供一種用于人糞便中的病原微生物基因組建庫的核酸提取試劑盒，其包括：核酸釋放劑Lysis A、增強劑Lysis Enhancer、去抑制劑IRT、結合液Binding Buffer、洗滌液1和洗滌液2；

所述的核酸釋放劑Lysis A包括20mM～40mM EDTA、40mM～80mMTri-HCl、2％～5％PVP-40(質量分數)、溶劑為DEPC水，PH值為9-10；