[發(fā)明專利]一種通過FOXP1基因編輯和突變延緩間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110275408.X
• 申請日: 2021-03-15
• 公開（公告）號: CN112941106B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭熙志;凌世烽
• 申請（專利權(quán)）人: 安可來（重慶）生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/88;C12N15/87;C12N15/55;C12N15/12;C12N15/10;C12N5/10
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種通過FOXP1基因編輯和突變延緩間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的方法。包括以下步驟：(1)分離和培養(yǎng)人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；(2)將質(zhì)粒、供體DNA、脂質(zhì)體加入到步驟(1)得到的培養(yǎng)液中進(jìn)行轉(zhuǎn)染；(3)將步驟(2)轉(zhuǎn)染后的人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)入含青霉素、鏈霉素的人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；(4)將步驟(3)培養(yǎng)后的人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行篩選培養(yǎng)；(5)將步驟(4)培養(yǎng)后的人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞消化傳代，待擴增至獲得穩(wěn)傳的細(xì)胞株即可。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明能明顯促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖速度快1倍，延緩其細(xì)胞衰老進(jìn)程達(dá)50％的效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種通過FOXP1基因編輯和突變延緩間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一種非造血系統(tǒng)的成體多能干細(xì)胞，F(xiàn)riedenstein最早提出MSCs的概念，用于定義一群干細(xì)胞，可以在體外形成成纖維細(xì)胞克隆聚落(CFU-F)，還能進(jìn)行成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞三系分化(Friedenstein etal.，1966)。它具有高度的自我更新能力，同時具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的能力(Caplan,2017)。大部分研究將成骨、成脂肪和成軟骨的三系分化能力作為定義間充質(zhì)干細(xì)胞的“金標(biāo)準(zhǔn)”(Bianco et al.，2008b)。MSC細(xì)胞表面標(biāo)記包括CD73，CD90和CD105，但不表達(dá)CD11b，CD14，CD34，CD45，和HLA-DR。

目前，MSCs已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于組織損傷修復(fù)，退行性疾病治療和免疫抑制的研究(Trounson and McDonald,2015)。截止到2020年目前，世界范圍內(nèi)在ClinicalTrials.gov上登記的MSCs相關(guān)的臨床試驗已超過930項，其中國內(nèi)的超過200項。MSC可以用來移植治療各種疾病(Ankrum and Karp，2010；Newman et al.，2009；Uccelli et al.，2008)，包括關(guān)節(jié)損傷(Barry，2003)；心肌缺血(Amado et al.，2005)，成骨發(fā)育不全癥(Horwitz et al.，2002)，移植免疫排斥(Newman et al.，2009)等。

目前這些MSCs細(xì)胞治療效果并不理想，在臨床上廣泛應(yīng)用存在障礙，主要有如下原因：其一，原代的MSCs來源和數(shù)量有限，其次依靠傳統(tǒng)方法從骨髓，臍帶血等組織分離的MSCs，其細(xì)胞群體異質(zhì)性比較大；同時體外擴增容易出現(xiàn)增殖性衰老(replicativesenescence)，移植入體內(nèi)的MSCs存活時間短(Mao et al.,2019)，不能有效地修復(fù)受損的組織(Duffield et al.,2005)。MSC體外傳代培養(yǎng)過程中，前6-8代細(xì)胞相對正常(Khoo etal.，2008)，但長時間傳代培養(yǎng)容易導(dǎo)致形態(tài)和分化能力發(fā)生改變，如MSC傳代10-15代后，它仍能保留成骨分化的潛能，但成脂分化能力卻喪失了(Digirolamo et al.，1999)。人源MSC的傳代培養(yǎng)還會導(dǎo)致增殖潛力的不斷下降，端粒長度縮短等衰老癥狀(Baxter et al.，2004；Digirolamo et al.，1999；Mets and Verdonk，1981)。這些體外培養(yǎng)導(dǎo)致的MSC衰老和增殖潛力下降，限制了MSC的移植和臨床治療應(yīng)用。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP1是一類新型的MSCs抗衰老因子(Li et al.,2017)。FOXP1在MSCs中的表達(dá)水平，隨衰老進(jìn)程而下降。FOXP1蛋白可能通過直接抑制p16INK4a的表達(dá)，調(diào)控MSCs的衰老。在人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞s細(xì)胞當(dāng)中過表達(dá)FOXP1基因，能明顯促進(jìn)MSCs自我更新和增殖，延緩其衰老進(jìn)程。通過細(xì)胞生物學(xué)或遺傳學(xué)方法，改變MSC細(xì)胞當(dāng)中衰老相關(guān)基因的表達(dá)水平，可以通過病毒載體，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒等方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞。我們根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)申請了專利(201611085228.0)，通過病毒和表達(dá)質(zhì)粒等方式過表達(dá)FOXP1，延緩MSCs的衰老。