[發(fā)明專利]基于熒光的多循環(huán)核酸測(cè)序反應(yīng)用成像試劑、試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110271458.0
• 申請(qǐng)日: 2021-03-12
• 公開（公告）號(hào): CN115074425A
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王玲玲;王亞文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 鄭州思昆生物工程有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及基因測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于熒光的多循環(huán)核酸測(cè)序反應(yīng)用成像試劑、試劑盒。本發(fā)明成像試劑中通過3,4?二羥基苯甲酸乙酯、4?羥基?3?甲氧基苯乙酮和抗壞血酸鈉的復(fù)配協(xié)同增效，減少自由基的產(chǎn)生，抑制成像過程中的核酸損傷，降低定相和預(yù)定相，最終提高長讀長測(cè)序的準(zhǔn)確性。傳統(tǒng)的成像試劑，為了提高測(cè)序讀長，選擇在成像試劑中添加抗氧化劑、熒光猝滅抑制劑和自由基清除劑等三種功能性組分，相比現(xiàn)有的成像保護(hù)劑，本發(fā)明創(chuàng)造性的選擇3,4?二羥基苯甲酸乙酯、4?羥基?3?甲氧基苯乙酮和抗壞血酸鈉三種抗氧化劑復(fù)配使用，發(fā)揮協(xié)同增效作用，省去添加使用熒光猝滅抑制劑和自由基清除劑。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于熒光的多循環(huán)核酸測(cè)序反應(yīng)用成像試劑、試劑盒。

背景技術(shù)

基于結(jié)合熒光標(biāo)記的核酸類似物的連續(xù)循環(huán)的核酸測(cè)序方法在本領(lǐng)域中是已知的。在這種“合成測(cè)序”或“循環(huán)測(cè)序”方法中，包括使用DNA聚合酶或DNA連接酶進(jìn)行多次延伸反應(yīng)，以連續(xù)地?fù)饺肱c模板鏈互補(bǔ)的熒光標(biāo)記的多核苷酸，通過檢測(cè)熒光標(biāo)記信號(hào)確定摻入的多核苷酸的種類。熒光信號(hào)的檢測(cè)依賴于激發(fā)態(tài)吸光發(fā)色團(tuán)的電磁輻射發(fā)射，可導(dǎo)致核酸損傷，并且在核苷酸添加的每個(gè)循環(huán)中所摻入的熒光團(tuán)的亮度降低。大量的分析研究表明在熒光檢測(cè)的照射期間隨著循環(huán)次數(shù)的增加熒光信號(hào)減弱的原因大致包括熒光分子由基態(tài)至激發(fā)態(tài)躍遷所產(chǎn)生的氧自由基等活性分子容易直接或間接的引起嘧啶二聚和核酸損傷，因此部分研究表明需要在成像試劑中添加使用抗氧化劑。

例如專利WO2006064199中公開，在陣列的情況下進(jìn)行反復(fù)的熒光檢測(cè)步驟引起的熒光信號(hào)強(qiáng)度損失，通過向檢測(cè)溶液中添加抗壞血酸鹽部分地解決了該問題，從而將可用檢測(cè)循環(huán)數(shù)從不存在抗壞血酸鹽的情況下的約8個(gè)至10個(gè)循環(huán)增加到存在抗壞血酸鹽的25個(gè)循環(huán)。鑒于此，需要進(jìn)一步延長測(cè)序的讀長，就需要對(duì)成像試劑做進(jìn)一步的優(yōu)化研發(fā)，降低核酸的光損傷，提高熒光信號(hào)強(qiáng)度，提高測(cè)序的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的之一是提供一種基于熒光的多循環(huán)核酸測(cè)序反應(yīng)用成像試劑，多種抗氧化劑的復(fù)配，發(fā)揮協(xié)同增效作用，延長測(cè)序讀長，提高測(cè)序準(zhǔn)確性。

同時(shí)，本發(fā)明還在于提供一種基于熒光的多循環(huán)核酸測(cè)序反應(yīng)用試劑盒。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種基于熒光的多循環(huán)核酸測(cè)序反應(yīng)用成像試劑，包括3,4-二羥基苯甲酸乙酯、4-羥基-3-甲氧基苯乙酮和抗壞血酸鈉。

可選的，上述成像試劑中3,4-二羥基苯甲酸乙酯、4-羥基-3-甲氧基苯乙酮和抗壞血酸鈉的濃度配比為1：1：2.5。作為進(jìn)一步優(yōu)選的，上述成像試劑中不包括熒光猝滅抑制劑和自由基清除劑。

本發(fā)明成像試劑中通過3,4-二羥基苯甲酸乙酯、4-羥基-3-甲氧基苯乙酮和抗壞血酸鈉的復(fù)配協(xié)同增效，減少自由基的產(chǎn)生，抑制成像過程中的核酸損傷，降低定相和預(yù)定相，最終提高長讀長測(cè)序的準(zhǔn)確性。傳統(tǒng)的成像試劑，為了提高測(cè)序讀長，選擇在成像試劑中添加抗氧化劑、熒光猝滅抑制劑和自由基清除劑等三種功能性組分，相比現(xiàn)有的成像保護(hù)劑，本發(fā)明創(chuàng)造性的選擇3,4-二羥基苯甲酸乙酯、4-羥基-3-甲氧基苯乙酮和抗壞血酸鈉三種抗氧化劑復(fù)配使用，發(fā)揮協(xié)同增效作用，省去添加使用熒光猝滅抑制劑和自由基清除劑。

進(jìn)一步優(yōu)選的，為了提高成像試劑的穩(wěn)定性，上述成像試劑中還包括3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽，促進(jìn)成像試劑中各組分的溶解，提高成像試劑整體的制備和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

可選的，上述成像試劑中還包括Tris緩沖劑。