[發明專利]一種基因重組蛋白Tat-hMsrA的高純度純化方法

在審

• 申請號: 202110271359.2
• 申請日: 2021-03-11
• 公開（公告）號: CN113088499A
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: 曾建華;閆云云;胡雪平
• 申請（專利權）人: 嘉興玖肽生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C07K19/00;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;C12R1/125
• 代理公司: 武漢藍寶石專利代理事務所(特殊普通合伙) 42242
• 代理人: 謝洋

本發明公開了一種基因重組蛋白Tat?hMsrA的高純度純化方法，包括以下步驟：S1，獲取表達融合蛋白Trx?Tat?hMsrA的枯草芽孢桿菌菌液；S2，將所述枯草芽孢桿菌菌液重懸，RIPA裂解液裂解，離心，棄上清；S3，將沉淀用PBS漂洗，而后重懸于RIPA裂解液中，再次裂解；S4，將裂解混合液離心，棄上清，而后向蛋白沉淀中加入腸激酶酶切緩沖液酶切；S5，將混合溶液中復性；S6，將復性混合物先經納濾除去雜質，而后經離子交換層析柱層析純化，收集目標蛋白Tat?hMsrA，即得。本發明操作步驟簡單，獲得的目標蛋白純度高，活性高，而且收率也較高。

技術領域

本發明屬于生物芯片制造領域，具體涉及一種基因重組蛋白Tat-hMsrA的高純度純化方法。

背景技術

蛋氨酸亞砜還原酶A是繼超氧化物歧化酶之后的另一種引起廣泛關注的抗氧化酶。與超氧化物歧化酶相比，蛋氨酸亞砜還原酶A不僅有在細胞內發揮清除氧化因素的作用，還可以對受損蛋白質進行有效修復。蛋氨酸亞砜還原酶A(MrsA)是一種很強的抗氧化酶。細胞穿透肽Tat安全無毒，可穿透細胞、血腦屏障，兩者結合獲得的人源性重組蛋白Tat-hMrsA可有望用于化妝品、保健品和藥品中。

論文“蛋氨酸亞砜還原酶A對線粒體氧化應激損傷的保護作用及基因重組Tat-hMsrA中試工藝研究”中指出：使用基因工程的方法構建pet32a-Tat-hMsrA質粒，并從BL21(DE3)、gammi、rosseta、gold篩選最合適的大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)，然后進行蛋白的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達，發現目標蛋白主要在包涵體表達，需要進行目標蛋白的變形和復性。但是從包涵體得到純化目標蛋白，檢測后無活性。

公開號為CN110283798A，發明名稱為一種基因重組蛋白Tat-hMsrA的純化方法的中國發明專利公開了一種基因重組蛋白Tat-hMsrA的純化方法。該純化方法能夠有效確保純化的蛋白具有活性。但是整體來說，其收率、純度和蛋白活性均不甚理想。從其電泳圖可以看出，純化后的蛋白中明顯含有雜質蛋白，而且純化后的蛋白活性也不高。

發明內容

本發明針對現有技術中存在的至少一種技術問題，提供一種基因重組蛋白Tat-hMsrA的高純度純化方法，本發明操作步驟簡單，獲得的目標蛋白純度高，活性高，而且收率也較高。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種基因重組蛋白Tat-hMsrA的高純度純化方法，包括以下步驟：

S1，獲取表達融合蛋白Trx-Tat-hMsrA的枯草芽孢桿菌菌液；

S2，將所述枯草芽孢桿菌菌液重懸，加入RIPA裂解液，4℃以下溫度下裂解，離心，棄上清后得沉淀；

S3，將所述沉淀用PBS漂洗，而后重懸于RIPA裂解液中，再次在4℃以下溫度下裂解，得裂解混合液；

S4，將所述裂解混合液離心，棄上清，而后向蛋白沉淀中加入腸激酶酶切緩沖液酶切，得酶切后的混合溶液；

S5，將向所述混合溶液中加入復性溶液，復性，得復性混合物；

S6，將所述復性混合物先經納濾除去雜質，而后經離子交換層析柱層析純化，收集目標蛋白Tat-hMsrA，即得。

在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。

進一步，所述步驟S2和步驟S3中，4℃以下溫度下裂解采用冰上裂解的方式完成。

進一步，所述步驟S2中，裂解時間控制在15min。

進一步，所述步驟S3中，PBS漂洗3～5次。

進一步，所述步驟S3中，裂解時間控制在15～20min。

進一步，所述步驟S2和S4中，所述離心操作溫度控制在4℃，以12000rpm離心。