[發明專利]一種發酵法制備微生物源殼寡糖的方法

有效

• 申請號: 202110265622.7
• 申請日: 2021-03-11
• 公開（公告）號: CN112941131B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發明（設計）人: 蔡寶國;榮紹豐;管世敏;李茜茜;黃煜玲
• 申請（專利權）人: 上海應用技術大學
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26;C12N1/20;C12N1/14;C12R1/66;C12R1/10
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 徐俊

1.一種發酵法制備微生物源殼寡糖的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1)：曲霉發酵：將曲霉斜面孢子轉接于種子液中培養，再將培養好的種子液轉接于發酵培養基中培養，進行曲霉發酵；所述發酵所用的曲霉為赭曲霉，其分類命名為赭曲霉，拉丁文名稱為Aspergillus?ochraceus，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，即CGMCC，菌種保藏編號為：CGMCCNo.15668，保藏日期為：2018年04月25日，保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號；

步驟2)：地衣芽孢桿菌發酵：向步驟1)得到的曲霉發酵液中補加已滅菌的營養液，攪拌均勻，調節發酵液pH至5.5-7，再于無菌操作下接入5-30g/L地衣芽孢桿菌粉，繼續發酵；

步驟3)：乳酸菌發酵：向步驟2)得到的發酵液于無菌操作下接入5-20g/L的乳酸菌粉，繼續發酵，即獲得含有殼寡糖的液體發酵物；

步驟4)：除渣除菌處理：將步驟3)獲得的含有殼寡糖的液體發酵物，在攪拌狀態下加入固體氫氧化鈣調節pH至6.5-7.5，過濾除渣除菌，得到含有殼寡糖的澄清透明液體；

步驟5)：吸附處理：將步驟4)獲得的液體用氫氧化鈉溶液調節pH至8.0-10.5，按照固液質量比1:10-1:30，加入弱堿性離子交換樹脂，進行吸附，吸附結束后過濾去除樹脂，調節溶液至中性，獲得殼寡糖溶液；

步驟6)：醇沉干燥處理：向步驟5)獲得的殼寡糖溶液中加入其3-4倍體積的無水乙醇攪拌均勻，靜置過夜后取沉淀，沉淀用乙醇溶液洗滌4-6次，置于冷凍干燥機中干燥，獲得白色雪花狀殼寡糖固體粉末。

2.如權利要求1所述的發酵法制備微生物源殼寡糖的方法，其特征在于，所述步驟1)中種子液的制備方法為：將菌種于無菌操作下吸取0.1-0.12mL并均勻涂布于斜面培養基中，27-30℃恒溫培養4-6天，得到發酵所需要的菌種，于無菌操作下，刮取黃色孢子并轉移至無菌生理鹽水中，制備得到孢子濃度為4.0×10⁸-7.0×10⁸個孢子/mL的孢子懸液；按照10-15wt％的接種量將孢子懸液轉接于種子培養基中，于27-30℃恒溫搖床中170-200rpm培養24-30h；將種子液按照10-15wt％的接種量，無菌操作下轉接于發酵培養基中，在溫度27-30℃，轉速100-450rpm，通氣比為0.4v/v/min-1.6v/v/min條件下培養36-48h，然后升溫至45-65℃，并用氫氧化鈉溶液調節pH至6.0-8.0，保溫攪拌12-24h。

3.如權利要求2所述的發酵法制備微生物源殼寡糖的方法，其特征在于，所述斜面培養基的原料包括以重量份數計的去皮馬鈴薯200-220份，葡萄糖20-25份，瓊脂20-23份及加水1000份，其pH值為6-6.8，并于121℃濕熱滅菌30min；所述的種子培養基的原料包括以重量份數計的蔗糖8-15份，酵母粉8-15份，糖蜜2-8份及加水1000份，其pH值為6-7，并于121℃濕熱滅菌30min；所述的發酵培養基的原料包括以重量份數計的蔗糖20-30份，可溶性淀粉10-20份，酵母粉5-10份，黃豆粉8-15份，糖蜜1.5-4份，乙酸鈉0.1-1份及加水1000份，其pH值為5.5-7，并于121℃濕熱滅菌30min。

4.如權利要求1所述的發酵法制備微生物源殼寡糖的方法，其特征在于，所述步驟2)中補加的營養液包括以重量份計的葡萄糖17.5-70份，NaCl?0.35-2.8份，K₂HPO₄?0.6-1.8份，MgSO₄·7H₂O?0.4-0.9份，FeSO₄·7H₂O?0.01-0.04份，CaCl₂0.1-1.0份及加水200份，營養液配置好后，于121℃濕熱滅菌30min，冷卻后待用。

5.如權利要求1所述的發酵法制備微生物源殼寡糖的方法，其特征在于，所述步驟2)中地衣芽孢桿菌發酵的條件為：發酵時間12-24h，發酵溫度33-39℃，轉速100-350rpm，通氣比0.2v/v/min-1.0v/v/min。